6个品种马DRD4基因克隆与序列比较分析

从6个品种马的血液中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的人、鼠、雪貂的DRD4 cDNA基因保守区序列,设计3对特异性引物,另1对由文献所得,对6个品种马的DRD4基因分4段进行PCR扩增,经电泳检测,分别呈4条特异条带,将其分别克隆入pMD19-T载体中,进行序列测定并拼接序列,得到包括所有内含子的DRD4基因序列。分析结果表明,马DRD4基因含有4个外显子和3个内含子,所得序列与人、鼠和狗同源区比对,发现其同源性都达到了75%以上。对6个品种马DRD4基因序列比较发现,不同品种马之间,第1内含子和第3外显子存在一定的变异,包括转换、颠换、插入/缺失和VNTR。

马DRD4基因部分序列克隆和PCR-RFLP分析

克隆了马DRD4基因完整第1内含子及部分第1、2外显子序列,并用StuI限制性内切酶通过PCR-RFLP技术检测了包括引入品种、培育品种和地方品种6个类型共270匹马的DRD4基因部分序列多态性。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将酶切产物分离,并用银染法显色。结果经StuI内切酶消化表现出多态,由3种共显性等位基因控制,出现了6种基因型;经Hardy-Weinberg平衡检验,乌审马(WS)、巴而虎马(BH)和乌珠穆沁马(WZ)(P>0.05)达到平衡,而其余均未达到平衡(P<0.05)。

马DRD4基因部分序列的克隆及Sty Ⅰ酶切多态性分析

采用限制性内切核酸酶Sty Ⅰ对蒙古马和纯血马DRD4基因第一内含子及部分第一、第二外显子的1760bp扩增产物进行了PCR-RFLP多态性分析,共检测到6种基因型,由D、E、F3个复等位基因控制;通过酶切图谱分析发现,蒙古马和纯血马的DRD4基因第一内含子及部分第一、第二外显子的第357位和第1717位碱基表现出多态性;并对基因型频率和等位基因频率进行了统计分析,结果表明:DRD4基因的部分基因型频率和等位基因频率在2个群体之间差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);x2适合性检验结果表明纯血马DRD4基因此位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01),而蒙古马达到平衡(P>0.05)。