泡球蚴蛋白通过Wnt/β-Catenin信号通路调控小鼠肝星状细胞二肽基肽酶-4的表达研究

目的探讨泡球蚴蛋白对肝星状细胞中纤维化关键基因二肽基肽酶-4(Dipeptidyl Peptidase 4,DPP4)表达的调控机制。方法免疫组织化学法检测二肽基肽酶-4在泡型棘球蚴病患者肝脏病灶近端与远端的表达情况。体外培养小鼠肝星状细胞系JS1,以60μg/mL浓度的泡球蚴蛋白(Echinococcus multilocularis Protein,EmP)刺激JS1细胞,检测细胞活化及Wnt通路的激活情况,Wnt通路抑制剂(IWP-2)和激动剂(LY2090314)靶向干预检测肝星状细胞活化标志物COL1A1、α-SMA与PPARγ,Wnt通路关键分子Wnt5a、β-catenin、GSK3β以及DPP4的表达水平。结果免疫组化检测结果显示泡型棘球蚴病患者肝脏病灶近端DPP4的表达(5927±987.1)显著高于病灶远端(2478±696.9),差异有统计学意义(t=9.026,P<0.05);EmP可显著促进JS1细胞活化并促进DPP4的表达,差异有统计学意义(F_(DPP4)=10.65,P<0.05);与对照组相比,EmP刺激组Wnt通路激活,Wnt5a、β-catenin、p-GSK3β的表达水平上升,差异有统计学意义(WB:F_(Wnt5a)=18.28,Fβ-Catenin=14.98,FP-GSK3β=28.52;RT-qPCR:F_(Wnt5a)=27.29,F_(CTNNB1)=21.24,F_(GSK3β)=7.974,P<0.05);Wnt通路抑制剂IWP-2干预可抑制EmP蛋白对α-SMA、DPP4的表达的促进作用,上调PPARγ的表达,差异有统计学意义(WB:F DPP4=26.27,Fα-SMA=126.4,F_(PPAR-γ)=8.187;RT-qPCR:F_(DPP4)=41.23,F_(ACTA2)=185.2,F_(PPARG)=136.2,P<0.05);与EmP刺激组相比,Wnt通路激动剂可促进JS1细胞的活化及DPP4的表达,差异有统计学意义(WB:F_(DPP4)=151.0;RT-qPCR:F_(DPP4)=29.71,P<0.05)。结论EmP蛋白可通过激活Wnt/β-Catenin通路促进纤维化关键基因DPP4的表达。

体外不同培养条件对多房棘球蚴活力的影响研究

目的为了使多房棘球蚴在非寄生离体的情况下保持活力,利于移植,需要多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,Em)在体外不同影响因素下的最佳培养条件。方法选择不同的培养条件:生理盐水培养组、无钙镁PBS培养组、血清培养组、无血清培养组,在两种温度(37℃,4℃)下培养多房棘球蚴,每组1×10~4个虫体,连续培养5 d,以经典的染色方法:台盼蓝染色法、亚甲基蓝染色法、伊红染色法、Dil染色法对虫株进行活力染色并计数。第一组小鼠注射新鲜离体虫株、第二组小鼠注射4℃生理盐水处理24 h的虫株,一月后观察两处理组小鼠肝脏变化。结果随培养时间延长,台盼蓝染色结果显示,第1~5 d离体虫株生存率平均值分别为86.575%、94.600%、63.387%、51.225%、32.775%。差异有统计学意义(P<0.05)。生理盐水组、无钙镁PBS组、血清组、无血清组5 d体外培养平均生存率为50.95%、64.78%、72.50%、74.62%。台盼蓝染色结果显示,无血清组在4℃、37℃时平均生存率分别为56.475%、87.995%,两组间有统计学差异(P<0.05)。无血清组四种染色方法间无统计学差异(P>0.05)。离体虫株4℃静置24 h,生理盐水混悬注射组较新鲜离体虫株生理盐水混悬注射组小鼠动物造模感染程度低。结论37℃无血清培养的多房棘球蚴绦虫,较其余三组培养条件的体外生存率更高。进行多房棘球蚴体外移植时效果更佳,为实验室提高泡球蚴动物造模成功率,延长虫体体外生存周期奠定了基础。

2,5-二氯-N-(2-甲基-4-硝基苯基)苯磺酰胺促进脂肪间充质干细胞向肝细胞分化

目的:探讨2,5-二氯-N-(2-甲基-4-硝基苯基)苯磺酰胺(FH535)对脂肪间充质干细胞(ADSCs)向肝细胞分化的作用。方法:人ADSCs取自2021年3月新疆医科大学第一附属医院整形科吸脂患者皮下脂肪组织,分为肝细胞诱导分化组(HDM组)和FH535处理组(HDM+FH535组),糖原染色、免疫荧光及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)等检测分化效率。组间比较采用独立样本t检验。结果:FH535处理组诱导的肝细胞(ihep)百分比在诱导后第3天[(13.184±0.822)%比(8.680±0.273)%,t=11.630,P<0.01]、第7天[(62.424±8.010)%比(20.736±4.790)%,t=9.988,P<0.01]、第14天[(75.164±12.118)%比(25.132±2.235)%,t=9.079,P<0.01]、第21天[(81.162±4.519)%比(51.622±8.362)%,t=6.950,P<0.01]显著高于HDM组;FH535处理组ihep数量在诱导后第7天(98.600±7.436比62.200±14.567,t=4.977,P<0.01)、第14天(149.600±16.682比56.200±4.207,t=12.140,P<0.01)、第21天(201.600±27.501比137.000±25.000,t=3.887,P<0.01)显著高于HDM组;FH535处理组糖原面积在诱导后第14天[(4655.952±2079.807)μm^(2)比(1360.518±360.849)μm^(2),t=3.491,P<0.01]、第21天[(6244.170±1827.871)μm^(2)比(3799.554±1395.081)μm^(2),t=2.377,P<0.05]显著高于HDM组;FH535处理组肝脏基因表达水平在诱导分化的第14天[白蛋白(ALB)(44.525±7.795比19.251±9.497,t=3.563,P<0.05)、转铁蛋白(Transferrin)(37.906±13.201比8.160±2.764,t=3.820,P<0.05)、肝细胞核因子-1B(HNF-1B)(7.229±1.900比3.147±0.232,t=3.695,P<0.05)、去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)(9.474±1.006比5.263±2.198,t=3.018,P<0.05)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)(6.921±2.529比2.085±0.409,t=3.269,P<0.05)、细胞角蛋白8(CK8)(7.707±3.049比0.807±0.143,t=3.916,P<0.05)]显著高于HDM组。结论:FH535可显著促进ADSCs的成肝细胞分化速率。

负载干细胞外囊泡的缓释聚左旋乳酸微球在促肝细胞增殖中的作用

目的制备一种调控释放干细胞外囊泡的微粒子递送系统,仅干预1次后长期发挥增强肝细胞增殖能力的作用。方法采用差速离心法提取干细胞外囊泡并鉴定,透射电镜观察外囊泡结构和免疫印记检测外囊泡膜标志蛋白,评价所提取外囊泡符合规范。采用乳液-溶剂挥发法制备“壳-核”结构聚左旋乳酸(poly-L-lactic acid,PLA)微球,在微球“核”结构位置负载干细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)得到EVs-PLA微球。通过扫描、透射电镜检测微球及外囊泡形貌,粒径分析,缓释实验检测EVs-PLA微球缓释周期,扫描电镜检测缓释至8周EVs-PLA微球形貌变化;将EVs-PLA微球与肝实质细胞共培养,鬼笔环肽/DAPI染色评价EVs-PLA微球生物相容性和细胞毒性,CCK8评价EVs-PLA微球对细胞增殖活力的影响作用,免疫印记检测EVs-PLA微球共培养后细胞中增殖标志蛋白表达量并统计数据结果。结果对比EVs-PLA干细胞外囊泡微球处理组和对照组的肝实质细胞增殖能力评价,发现EVs-PLA微球未造成细胞凋亡和细胞结构发生变异,具有生物相容性无细胞毒性;EVs-PLA微球的“壳-核”结构调控所负载的干细胞外囊泡的释放速率和释放周期,EVs-PLA微球可缓慢释放EVs,单次干预后持续发挥促进肝实质细胞增殖的生物作用。结论EVs-PLA微球可缓慢释放EVs,单次干预后持续发挥增强肝细胞增殖能力的作用,为探索外囊泡促肝细胞增殖的微递送系统提供了新的思路。

二肽基肽酶-4在泡球蚴感染致肝纤维化中的作用研究

目的 明确二肽基肽酶-4(DPP4)在泡球蚴感染所致肝纤维化中的作用。方法 取泡球蚴不同感染时期(1、3、6个月)小鼠肝脏组织,HE染色检查肝脏组织病理学变化,天狼星红染色法检测肝纤维化程度,免疫组织化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和DPP4的表达,采用相关分析法分析DPP4蛋白表达水平与肝纤维化的相关性。小鼠肝星状细胞(JS1),经60μg/ml泡球蚴蛋白(EmP)刺激后采用实时荧光定量PCR检测DPP4、α-SMA、COL1A1、TIMP1、MMP2的mRNA表达水平。结果 与对照组比较组,模型组小鼠感染泡球蚴后1、3、6个月α-SMA表达上调(阳性面积分别为3.521±0.8862、7.846±0.9873、15.34±0.6263)(均P<0.05),且呈时间依赖;天狼星红染色病灶旁纤维组织阳性面积增加(阳性面积分别为56979±9550、69844±763.8、82687±13774)(均P<0.05),且呈时间依赖;DPP4表达上调(阳性面积分别为5038±201.2、6110±174.4、9021±697.4)(均P<0.05),且呈时间依赖。泡球蚴感染小鼠DPP4表达水平与α-SMA相对表达量呈正相关(R^(2)=0.9166,P<0.05),与天狼星红阳性区域面积呈正相关(R^(2)=0.5368,P<0.05)。泡球蚴蛋白刺激小鼠肝星状细胞系JS1,肝星状细胞活化标志物α-SMA、COL1a1、TIMP1、MMP2 mRNA表达上调,DPP4的mRNA也随之上调(均P<0.05)。结论 DPP4参与泡球蚴感染所致肝纤维化过程并随纤维化加重表达上调,为阐明泡型棘球蚴病的致病机制和寻找新的治疗靶点奠定了基础。

荧光三维重建技术在细粒棘球蚴结构解析中的应用

目的利用激光共聚焦显微镜对体外培养的细粒棘球蚴进行荧光染色三维重建,探讨荧光三维重建技术在细粒棘球蚴结构解析中的应用价值。方法建立细粒棘球蚴体外培养体系,制作细粒棘球蚴冰冻切片,设置活体观察组、冰冻切片组及三维重建组3组,分别利用细胞核荧光染料DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)和细胞膜荧光探针DiI(1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate,DiI)对虫体进行染色,置于激光共聚焦显微镜下进行图像采集或三维重建,比较3种荧光成像方式的异同。结果DAPI及DiI荧光可分别标记出细粒棘球蚴的细胞核与细胞膜结构。活体观察组仅良好显示虫体外膜结构,与冰冻切片组及三维重建组相比,虫体内部结构荧光结合效率低,无法实现虫体内部结构解析;冰冻切片组虫体内外部结构荧光标记效率高,但虫体形态均由外翻型棘球蚴转变为内陷型,虫体表面出现明显皱缩,提示虫体结构遭到破坏;三维重建组虫体形态良好,虫体内外部结构荧光结果效率高,三维重建后可同时显示虫体内外部的荧光分布。结论荧光三维重建技术应用于细粒棘球蚴的结构解析,可获取荧光信号在细粒棘球蚴空间上的分布信息,具有较好的应用价值。

泡球蚴蛋白促进脂肪间充质干细胞向肝细胞分化的研究

目的 探讨泡球蚴蛋白(Echinococcus multilocularis protein,EmP)促脂肪间充质干细胞(Adipose tissue Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)向肝细胞分化的作用。方法 体外分离人脂肪组织来源的ADSCs,第三代(P3)ADSCs分为对照组(HDM肝细胞诱导分化组)和Em蛋白处理组(HDM+EmP组),经无血清肝细胞诱导培养基培养7、14和21 d,检测对照组和EmP处理组肝细胞样细胞(iHep)百分比、糖原染色面积、肝细胞标志物白蛋白(Albumin,ALB)的蛋白及基因表达水平。Western-Blot法检测p-GSK-3β的表达情况。结果 P3代ADSCs具有成脂及成骨分化能力并表达干细胞标志物(CD29、CD90和CD105等)。在ADSCs向肝细胞诱导分化14 d,EmP处理组iHep细胞百分比显著高于对照组(P<0.05),EmP处理组糖原染色面积显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示两组细胞在诱导分化7 d开始表达ALB,荧光强度随诱导时间增加呈增强趋势。qPCR结果显示在诱导分化后第14 d,EmP处理组ALB表达水平显著高于对照组,两组间具有统计学差异(P<0.05)。Western-Blot结果显示,诱导分化第7 d和14 d,EmP处理组p-GSK-3β蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01和P<0.05)。结论 Em蛋白可能通过激活GSK-3β而具有促进ADSCs向肝细胞分化的作用,本研究为临床应用ADSCs移植治疗泡型棘球蚴病奠定了基础。

整合素β1在肝泡型包虫病患者肝脏中的表达及其与临床病理特征的相关性

目的检测肝泡型包虫病(AE)患者肝组织中整合素β1(Integrinβ1)的表达水平,并探讨其与患者临床病理特征的相关性。方法取73例AE患者肝脏组织样品及8例正常肝脏样品做石蜡组织切片,采用免疫组织化学染色法检测Integrinβ1的表达情况,分析Integrinβ1的表达水平与Child-pugh分级、PNM分型、血管新生等临床病理特征的相关性。结果AE患者病灶近旁及远端肝组织integrinβ1表达显著高于正常肝组织(P<0.01)。相关性分析显示Integrinβ1表达与AE患者PNM分型及新生血管数(Integrinβ1高表达组23.7±10.78,低表达组16.09±7.35)呈正相关(P<0.05),且随着AE病灶范围(P分期)的加重,Integrinβ1呈高表达(P1,0%;P2,13.6%;P3,75.0%;P4,50%)(P<0.01),而与患者年龄、性别、Child-Pugh分级等无显著相关性(均P>0.05)。结论肝泡型包虫病患者的肝组织高表达Integrinβ1,提示Integrinβ1可能参与AE病灶浸润过程,为阐明AE的致病机制和寻找新的药物靶标奠定了基础。