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犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达
被引量:
3
1
作者
王晶宇
欧阳伟
+9 位作者
王永山
夏兴霞
诸玉梅
王晓丽
潘群兴
孟凯
毕振威
安欣
楼晶瑶
姚火春
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第4期448-454,共7页
为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其...
为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其他3种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev和pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现绿色荧光,用MDCK与MDB K细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒活性,活性分别为1.39×105和2.19×104U/m L。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了试验基础。
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关键词
犬干扰素α4(CaIFN-α4)
CHO细胞
真核表达
慢病毒
绿色荧光蛋白
原文传递
犬流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立
2
作者
楼晶瑶
王晓丽
+8 位作者
欧阳伟
夏兴霞
诸玉梅
潘群兴
王晶宇
安欣
姚凌云
王永山
刘永杰
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第6期680-686,共7页
旨在利用昆虫细胞表达犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作为抗原建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。从CIV感染的MDCK细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增NP基因,连接到pFastBacHTA载体上,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒NP-DH...
旨在利用昆虫细胞表达犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作为抗原建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。从CIV感染的MDCK细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增NP基因,连接到pFastBacHTA载体上,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒NP-DH10,穿梭质粒转染sf-9昆虫细胞,获得重组病毒P1-NP。病毒传至第3代后,用Western-blot及IFA鉴定昆虫细胞表达的蛋白与兔抗犬流感病毒NP蛋白多克隆抗体及鼠抗CIV血清发生特异性反应。NP蛋白纯化后作为抗原,建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。优化后确定蛋白最佳包被浓度为2 g/mL,血清最佳稀释度为1∶100。用建立的间接ELISA方法和血凝抑制(HI)同时检测136份血清样品,ELISA法检出129份阳性,检出率为94.85%;HI检出120份阳性,检出率为88.23%,二者符合率为93.38%,ELISA检测方法的阳性率高于血凝抑制。结果表明,利用昆虫细胞表达的NP蛋白做为抗原,建立的检测CIV抗体的间接ELISA方法特异性好,重复性高,可用于犬流感的诊断和流行病学调查。
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关键词
犬流感病毒
NP蛋白
杆状病毒表达系统
间接ELISA
原文传递
题名
犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达
被引量:
3
1
作者
王晶宇
欧阳伟
王永山
夏兴霞
诸玉梅
王晓丽
潘群兴
孟凯
毕振威
安欣
楼晶瑶
姚火春
机构
南京农业大学动物医学院
江苏省农业科学院
出处
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第4期448-454,共7页
基金
国家重点研发计划项目(2016YFD0501000)
公益性行业(农业)科研专项(201303042)
江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(15)1065]
文摘
为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其他3种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev和pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现绿色荧光,用MDCK与MDB K细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒活性,活性分别为1.39×105和2.19×104U/m L。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了试验基础。
关键词
犬干扰素α4(CaIFN-α4)
CHO细胞
真核表达
慢病毒
绿色荧光蛋白
Keywords
canine interferon α4(CaIFN-α4)
CHO cell
eukaryotic expression
lentivirus
green fluorescent protein(GFP)
分类号
R979.5 [医药卫生—药品]
原文传递
题名
犬流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立
2
作者
楼晶瑶
王晓丽
欧阳伟
夏兴霞
诸玉梅
潘群兴
王晶宇
安欣
姚凌云
王永山
刘永杰
机构
南京农业大学动物医学院
江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心.江苏南京
出处
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第6期680-686,共7页
基金
科技部国际合作专项(2014DFG32770)
国家重点研发计划项目(2016YFD0501000)
+2 种基金
公益性行业(农业)科研专项(201303042)
江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(15)1065]
江苏省优势学科建设项目(PAPD)
文摘
旨在利用昆虫细胞表达犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作为抗原建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。从CIV感染的MDCK细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增NP基因,连接到pFastBacHTA载体上,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒NP-DH10,穿梭质粒转染sf-9昆虫细胞,获得重组病毒P1-NP。病毒传至第3代后,用Western-blot及IFA鉴定昆虫细胞表达的蛋白与兔抗犬流感病毒NP蛋白多克隆抗体及鼠抗CIV血清发生特异性反应。NP蛋白纯化后作为抗原,建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。优化后确定蛋白最佳包被浓度为2 g/mL,血清最佳稀释度为1∶100。用建立的间接ELISA方法和血凝抑制(HI)同时检测136份血清样品,ELISA法检出129份阳性,检出率为94.85%;HI检出120份阳性,检出率为88.23%,二者符合率为93.38%,ELISA检测方法的阳性率高于血凝抑制。结果表明,利用昆虫细胞表达的NP蛋白做为抗原,建立的检测CIV抗体的间接ELISA方法特异性好,重复性高,可用于犬流感的诊断和流行病学调查。
关键词
犬流感病毒
NP蛋白
杆状病毒表达系统
间接ELISA
Keywords
canine influenza virus
NP protein
baculovirus expression system
indirect ELISA
分类号
S852.659.5 [农业科学—基础兽医学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达
王晶宇
欧阳伟
王永山
夏兴霞
诸玉梅
王晓丽
潘群兴
孟凯
毕振威
安欣
楼晶瑶
姚火春
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017
3
原文传递
2
犬流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立
楼晶瑶
王晓丽
欧阳伟
夏兴霞
诸玉梅
潘群兴
王晶宇
安欣
姚凌云
王永山
刘永杰
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017
0
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