菊花B病毒外壳蛋白互作蛋白的筛选

采用PCR扩增菊花B病毒(CVB)外壳蛋白基因的开放阅读框,构建酵母双杂交系统所需的诱饵表达载体pGBKT7-CVBCP,测序验证后转化Y2HGold酵母菌。将酵母菌Y187/pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7-CVBCP进行交配转化,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上筛选蓝色阳性克隆并测序pGADT7-cDNA的插入片段。结果表明:诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,且对报告基因无自激活作用。筛选菊花cDNA文库初步得到了与CVB外壳蛋白相互作用的E3泛素连接酶ARIADNE-like蛋白和ATP结合蛋白,为进一步研究CVB外壳蛋白与寄主的互作机制奠定了基础。

菊花翻译起始因子4E基因的克隆、表达分析及其互作蛋白的筛选

【目的】为了研究翻译起始因子4E在菊花中的表达特性及功能,克隆菊花翻译起始因子4E(CmeIF4E)基因,分析其表达特性并初步筛选得到菊花CmeIF4E的互作蛋白。【方法】根据已报道植物的eIF4E序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术克隆菊花eIF4E基因,荧光定量PCR及亚细胞定位分析菊花CmeIF4E的表达特性,并用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白。【结果】克隆获得菊花eIF4E基因全长914 bp,其开放阅读框(ORF)654 bp,编码1条包含218个氨基酸残基的多肽,将该基因名为CmeIF4E,GenBank登录号为JQ904591。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,菊花CmeIF4E与已报道的莴苣的同源基因亲缘关系最近,该结果与植物分类学相符。荧光定量PCR分析结果显示,CmeIF4E基因在切花菊‘神马’各个器官中均有表达,幼嫩的根中表达量最高,其次是叶片,而茎中表达量最低。亚细胞定位分析发现,CmeIF4E在细胞的核、质、膜上都有表达。筛选得到菊花CmeIF4E互作蛋白,其中包括蛋白翻译和翻译后修饰、光合作用、抗逆和防御等相关蛋白。【结论】CmeIF4E在菊花组织中为组成型表达,亚细胞定位显示其在细胞核、细胞质、细胞膜上都有表达。候选蛋白分析验证了CmeIF4E在翻译起始中的作用,还推测其可能与光合系统、植物的抗逆防御相关,结果为进一步研究该蛋白在菊花中的作用提供了重要依据。

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系。结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol.L-1 Mg2+、300μmol.L-1 dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、4μmol.L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer。各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA。用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性。