抗烟曲霉乳酸菌菌株的筛选、鉴定及特性初步研究

采用双层平板法从婴儿粪便中筛选出一株对烟曲霉具有抑制作用的菌株,通过形态学、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析,鉴定该菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei),命名为LZ54。分别经pH、蛋白酶、XAD-2大孔树脂处理该菌株发酵液上清后,发现LZ54发酵液在酸性条件下具有较强的抗烟曲霉活性,但在碱性条件下其抑菌物质迅速失活;发酵液上清经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K处理后失去部分抑菌活性,表明该菌株发酵液中抗烟曲霉的物质具有蛋白质属性;发酵液经XAD-2大孔树脂处理后仍具有抑制烟曲霉活性,并通过SDS-PAGE方法测得该抑菌物质的分子量约为5 kD。

2016-2020年浙江省禽类相关外环境禽流感病毒污染状况及职业暴露人群血清监测

目的了解2016—2020年浙江省禽类相关外环境中禽流感病毒的污染状况和职业暴露人群中禽流感病毒的感染情况,为浙江省禽流感防控工作提供科学依据。方法采用Real-time RT-PCR对外环境标本进行甲型流感病毒通用型(A型)核酸检测,A型阳性的标本再进行H5、H7和H9亚型的禽流感病毒核酸检测,采用红细胞凝集抑制试验对职业暴露人群血清标本进行H5N6、H7N9、H9N2检测,采用描述性分析对检测结果进行统计分析。结果2016—2020年浙江省每年均在禽类相关外环境中检出禽流感病毒阳性标本,共检出A型阳性标本10106份,总阳性率为24.60%,H5阳性标本525份,阳性率为1.28%,H7阳性标本1137份,阳性率为2.77%,H9阳性标本3634份,阳性率为8.84%,且存在H5+H7、H5+H9、H7+H9、H5+H7+H9混合阳性的标本;城乡活禽市场、家禽屠宰加工厂、家禽散养户集中地区、家禽规模养殖(户)、野生候鸟栖息地5类场所中采集的宰杀或摆放禽肉案板表面擦拭标本的禽流感病毒A型阳性检出率最高,达48.33%;冬春季时外环境中检出禽流感病毒阳性比例较高;2888份职业暴露人群血清标本中检出1份H5N6和9份H9N2阳性标本,城乡活禽市场、家禽屠宰加工厂、家禽散养户集中地区、家禽规模养殖(户)4类场所均有分布,但以城乡活禽市场中检出较多。结论浙江省禽类相关外环境中禽流感病毒以H9亚型为主,H5亚型每年均有检出,H7亚型主要集中在2016和2017年,存在混合阳性的标本,有病毒重组的风险;职业暴露人群中存在H5N6和H9N2隐性感染,应加强禽流感病毒的防控工作,做好职业人群的安全宣教工作,加大禽流感的监测力度。

应用ddPCR检测甲型H1N1 pdm09流感病毒H275Y突变研究

目的评价微滴式数字PCR(ddPCR)检测甲型H1N1 pdm09流感病毒神经氨酸酶(NA)H275Y突变的方法。方法根据甲型H1N1 pdm09流感病毒NA片段包含275氨基酸位点的序列信息设计引物和双探针,优化ddPCR退火温度,建立甲型H1N1 pdm09流感病毒H275耐药敏感基因和H275Y耐药突变基因检测方法。采用检出限比较ddPCR和荧光定量PCR(qPCR)的灵敏度,通过检测甲型H1N1 pdm09、季节性H1N1、甲型H3N2流感病毒等14种呼吸道病毒样本比较ddPCR和q PCR的特异性。检测64份临床标本和5株流感病毒株,获得拷贝数,计算H275Y突变丰度,并将5株毒株的突变丰度与二代测序结果进行比较。结果确定62.2℃为最优退火温度。采用ddPCR和qPCR检测甲型H1N1 pdm09 H275耐药敏感质粒和H275Y耐药突变质粒,ddPCR检出限分别为5.28(95%CI:4.28~7.45)和6.51(95%CI:5.25~9.37)拷贝/反应;qPCR检出限分别为5.70(95%CI:4.83~7.45)和7.06(95%CI:5.92~9.40)拷贝/反应。ddPCR和qPCR均能检出甲型H1N1 pdm09样本中的H275耐药敏感质粒和H275Y耐药突变质粒,其他11种呼吸道病毒均未检出,两种方法检测结果一致。64份临床标本中,ddPCR检出1例感染甲型H1N1pdm09的重症肺炎患者的3份咽拭子标本存在H275Y突变,使用磷酸奥司他韦治疗第4天采集的标本突变丰度最高,为53.37%。ddPCR检测分离自该病例治疗第2、4、5天标本的流感病毒H275Y突变丰度分别为0.63%、88.93%和1.27%;二代测序检测治疗第4天标本的H275Y突变丰度为89.46%,未检测到治疗第2、5天标本存在H275Y突变。结论ddPCR的灵敏度和特异性较qPCR高,对低频突变的检测灵敏度较二代测序高,可定量检测甲型H1N1 pdm09流感病毒NA片段H275Y突变。

基于TLDA技术的甲型流感病毒高通量快速分型方法的建立及应用

目的开发用于甲型流感病毒快速分型的Taqman低密度芯片(Taqman low density array,TLDA),可以同时开展甲型流感病毒通用、H1-H16及N1-N9亚型高通量快速鉴定,适用于流感样病例及禽流感标本中甲型流感病毒的快速分型鉴定。方法设计甲型流感病毒通用、H1-16亚型、N1-9亚型的引物探针,并将其预先定制在TLDA反应芯片上;优化TLDA退火温度;用多种亚型的甲型流感病毒核酸进行10倍梯度稀释,结合微滴式数字PCR定量方法评价TLDA检测灵敏度;用乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞等其他多种常见的呼吸道病毒验证该TLDA检测特异性,同时选用多种已经明确分型的甲型流感病毒评价该TLDA的特异性和有效性;采集16例流感样病例标本及24例禽流感外环境标本用该芯片开展检测。结果该TLDA的最佳退火温度为60℃;针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N6、H7N9和H9N2,其检测灵敏度为1.52~8.00拷贝/μl;能特异性检测甲型流感病毒,与其他常见呼吸道病毒无交叉反应,并能精准鉴定多种甲型流感病毒的亚型;应用该方法检测16例流感样病例标本和24例禽流感外环境监测标本,均可分型。结论基于TLDA技术建立的甲型流感病毒高通量快速分型检测方法具有较好的灵敏度和特异性,适用于流感样病例和禽流感标本的病原快速检测,特别是对目前用常规商业化试剂尚无法鉴定的新型甲型流感病毒能够进行快速的亚型筛查与鉴定。

浙江省2013年输入性登革热病例病原分子溯源

目的对2013年浙江省登革热病例进行实验室确诊与病原的分子溯源。方法对患者血清样本同时进行登革热病毒Ig M抗体和核酸检测及病毒分离,阳性分离株采用RT-PCR方法扩增E基因,进行核苷酸序列测定和同源性与进化分析。结果 18例患者发病前均有在境外登革热流行区暴露史,从患者18份血清样本中检测到登革热病毒Ig M抗体阳性15份（83.3%）,核酸阳性8份（44.4%）,分离到登革热1型病毒6株,4型1株。6株登革热1型株之间E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9%~99.7%和96.8%~100%,与浙江省2004年登革热1型株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为91.4%~98.5%和96.6%~99.0%;E基因进化树显示,登革热1型株位于GⅠ、GⅣ和GⅤ基因亚型上,登革热4型株位于GⅠ亚型上,2013年7株登革热病毒与浙江省2004-2009年登革热病毒之间亲缘关系较远。结论证实2013年浙江省登革热病例均为输入性,输入国为菲律宾、安哥拉、斯里兰卡和巴西等;登革热1型株基因亚型分别为亚洲型、南太平洋型和美洲/非洲型,登革热4型株为东南亚型;登革热4型病毒为浙江省首次分离。

1株产细菌素乳酸菌的鉴定和细菌素的分离纯化

从婴儿粪便中分离获得1株能够产生抑菌活性物质的菌株,经生理生化和16S rDNA鉴定,该菌为干酪乳杆菌,命名为Lactobacillus casei LZ55。在排除有机酸、过氧化氢的干扰后,该菌发酵上清液仍有明显的抑菌活性;而将发酵上清用蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后抑菌活性丧失,表明该菌株产生的抑菌活性物质具有蛋白质性质,初步确定为1种细菌素。抑菌谱测定结果表明,该细菌素不仅能够抑制革兰氏阳性菌(单增李斯特氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等),而且能够抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺氏菌等)。通过大孔吸附树脂(XAD-2)初步提纯该细菌素,经SDS-PAGE试验分析,该细菌素分子质量为4.2 ku。

应用高通量测序技术快速鉴定未分型甲型流感病毒

目的利用Ion Torrent半导体二代测序技术开展禽类和外环境中禽流感病毒基因组测序和亚型的快速鉴定，建立快速豁定未分型甲型流感病毒亚型的高通量测序厅法。方法提取9份禽类拭子和外环境标本中的病毒RNA，进行甲型流感病毒通用型、H5N1亚型、H7N9亚型和H9N2业型荧光定量PCR检测；利用PathAmpFluA试剂盒对病毒RNA进行全基因组扩增，利用Next Fast DNA Fragmentation＆Library Prep Set low Ion Torrent试剂盒进行义库制备，并存Ion torrent二代测序仪上完成测序；采用Ion Torrent Suitev3．0进行测序数据提取和质量评估，并且用Flu Atyping v4．0和PathogenAnalyzer两个捕件进行流感序列拼接和数据库比对，最终确定9份禽流感标本的流感病毒业型。结果9份禽类拭子和外环境标本甲型流感病毒核酸阳性但常规监测的H5N1、H7N9和H9N2亚型均为阴性，经二代测序和生物信息学分析共鉴定出7种亚型：H2N3、H5N6、H5N8、H7N1、H7N7、H11N3业型流感病毒阳性标本各1个，H6N6亚型流感病毒阳性标本3个。结论浙江省外环境中禽流感病毒亚型众多，Ion torrent半导体测序技术适用于禽及外环境监测巾发现的末分型甲型流感病毒业型的快速鉴定。

新型人感染H7N9禽流感病毒病原学研究进展

2013年中国暴发的新型人感染H7N9禽流感引起了全世界的关注。本文通过整理目前已发表在数据库(PubMed)上的新型人感染H7N9禽流感病原学方面文章,对关于该病毒核酸检验、序列分析、溯源研究,以及其致病力、耐药性和传播力研究等方面已经明确的结论进行综述。该病毒核酸可以通过各种数量实时定量PCR方法检测,有较好的敏感度和特异性,能较快获得检测结果,其中逆转录实时荧光定量PCR仍是目前检测的主流方法。该病毒来自于禽类,对禽类属于低致病性病毒,但经过近几年的多次重组事件后,已能和人呼吸道受体α-2,6Gal结合,并可通过直接接触传播感染人类引起较为严重的临床过程。除H7N9之外,其他新重组形成H7亚型,如H7N7,亦具有较高的哺乳动物感染力,因此需加强对禽流感病原监测。相比容易感染青少年的高致病性人禽流感H5N1病毒,新型H7N9病毒更易引起老年人的严重呼吸系统症状。虽然已经出现耐神经氨酸抑制剂毒株,但是该病毒临床仍可用奥司他韦等药物进行治疗,目前已发现其他药物可以抑制耐药与非耐药毒株在体内的复制。如出现聚集性病例,其感染来源可能存在共同暴露史,但亦不能排除存在有限的、非持续的人传人可能。

基于高通量技术的SFTS病毒基因组测序方法的建立

目的建立一种基于高通量测序技术的发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTS)基因组的测序方法。方法提取SFTS病毒核酸,分别采用随机引物和oligo(dT)磁珠特异性抓取核酸的方法,优化扩增和纯化条件并建库,利用二代测序仪检测病毒核酸序列。结果3株病毒采用两种方法测序结果差距较大,利用随机引物建库法获得的数据测序深度和覆盖度明显低于oligo(dT)磁珠抓取建库法。采用oligo(dT)磁珠抓取建库的方法,可对提取的核酸大于300ng的毒株进行测序,3株病毒测序深度都在900以上,覆盖度均超过99%,与NCBI上数据匹配度在90%以上。结论利用oligo(dT)磁珠抓取SFTS病毒核酸的方法进行建库,建立了基于二代测序平台的SFTS病毒基因组检测方法。

发热伴血小板减少综合征病毒蛋白Gc原核表达及免疫原性研究

目的对原核表达发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)蛋白Gc免疫原性进行初步研究。方法参照SFTSV HB29病毒株包膜蛋白Gc编码基因,通过大肠埃希菌密码子偏好性优化后化学合成方法得到Gc目的基因。将目的基因导入到载体pET-His中,得到表达载体pET-His-Gc。经测序确认后转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达,纯化后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot验证。蛋白免疫新西兰大白兔后收集兔血清进行抗体效价测定。结果成功构建了pET-His-Gc融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中得到可溶性表达,且得到的Gc蛋白具有良好的免疫原性。动物实验结果表明,3次免疫后兔血清的抗体效价可达到1∶512 000。结论实现了SFTSV包膜蛋白Gc的原核表达,为后续SFTSV包膜蛋白的研究奠定了基础。