猪瘟病毒抗原检测技术研究进展

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度传染性和致死性疾病。该病呈世界性分布,在各国养猪产业中不同程度地流行,给养猪业造成巨大损失,是养猪业的主要问题之一。因此早期精准的抗原检测是有效控制CSF的先决条件。目前已研发出多个针对CSFV病毒抗原的检测方法,如:病原分离鉴定、荧光抗体试验、免疫组织化学技术、酶联免疫吸附试验、免疫层析技术、RT-PCR、实时定量RTPCR、核酸等温扩增技术、微流控技术、基因芯片、CRISPR-Cas系统检测技术等。该文针对CSFV的抗原检测技术和方法进行综述,以期为CSFV的临床监测和CSF的防控提供参考。

猪瘟病毒抗体检测技术研究进展

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度传染性和致死性的病毒性疾病。该病流行广泛,呈世界性分布;发病率高、死亡率高,严重危害养猪业。目前疫苗免疫接种仍然是全球大多数养猪国家防控CSF的主要手段,因此正确利用试验室或临床检测技术检测CSFV抗体,准确评价猪群CSF疫苗免疫效果和评估非免疫猪群中是否存在CSFV感染,并在此基础上提出CSF防控措施至关重要。该文针对正相间接血凝试验、病毒中和试验、免疫层析技术、酶联免疫吸附试验、蛋白质芯片技术、荧光微球技术等目前常用的CSFV抗体检测技术和方法进行综述,以期为CSF免疫评估和CSF综合防控提供理论参考。

低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性

背景:以往研究发现低氧对间充质干细胞增殖、分化及细胞因子分泌等方面均有不同程度的影响,但低氧对犬脂肪间充质干细胞的影响尚未见相关研究。目的:探讨低氧环境对犬脂肪间充质干细胞生物学特性的影响。方法:通过酶消化法分离培养犬脂肪间充质干细胞,第2代时分为常氧组(氧气体积分数为21%)和低氧组(氧气体积分数为5%),比较了两组细胞的形态特征、增殖速度、细胞表面标志物、分化能力和细胞因子分泌水平等。结果与结论:①低氧环境下培养的脂肪间充质干细胞生长状况良好,细胞形态与常氧组一样,均呈梭形和多棱形;②低氧组的细胞增殖速度加快,细胞倍增时间比常氧组短(P均<0.05),成脂、成骨分化出现时间较早;③常氧组和低氧组脂肪间充质干细胞均高表达CD90、CD44和CD105,低表达CD45;④低氧组脂肪间充质干细胞的脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子mRNA表达量分别是常氧组的2.3倍(P<0.05)和3.0倍(P<0.05);⑤结果提示低氧环境对脂肪间充质干细胞的形态、表面标记物无明显影响,但对细胞增殖、分化和细胞因子分泌能力有促进作用。

奶牛脂肪来源间充质干细胞的分离培养及其生物学特性研究

【目的】建立奶牛脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)体外分离培养体系,并进行增殖能力检测、分化能力鉴定及生物学特性研究,为推广AD-MSCs在畜牧生产及其疾病治疗等方面的应用提供理论依据。【方法】通过I型胶原酶消化法分离奶牛AD-MSCs并进行代传培养,绘制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生长曲线及测定其群体倍增时间,分别采用流式细胞术及RT-PCR检测细胞表面标志物;使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基进行奶牛AD-MSCs成骨成脂诱导分化,经茜素红和油红O染色后鉴定其成骨成脂分化能力;并检测冻存奶牛AD-MSCs复苏后的存活率。【结果】分离及传代培养获得的奶牛AD-MSCs在体外培养条件下呈长梭形,折光性强,生长状态良好,其生长曲线呈典型的S形,符合Logistic生长规律。奶牛AD-MSCs高表达MSCs表面标志物CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达白细胞表面标志物CD45;分别使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基诱导的奶牛AD-MSCs经茜素红和油红O染色后,显微镜下可观察到大量的钙结节和红色脂肪滴。冻存6个月后进行细胞复苏,奶牛AD-MSCs的存活率高达96%;复苏奶牛AD-MSCs培养4 h内贴壁,呈典型的长梭形,生长状态良好,培养72 h细胞融合达80%~90%。【结论】通过I型胶原酶消化法从奶牛腹部脂肪组织分离获得的奶牛AD-MSCs具有良好的体外增殖能力及多向分化潜能,为畜牧生产研究及奶牛疾病治疗提供了一种良好的种子细胞来源。

猫脂肪间充质干细胞及其条件培养基对庆大霉素致损猫肾细胞增殖和凋亡的影响

试验旨在探究猫脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,AD-MSCs)及其条件培养基(adipose mesenchymal stem cells conditioned medium,AD-MSCs-CM)对庆大霉素致损的猫肾细胞(crandell rees feline kidney,CRFK)增殖和凋亡的影响及机制。试验分为空白组、庆大霉素(gentamicin,GM)组、AD-MSCs组和AD-MSCs-CM组;用Ⅰ型胶原酶消化法分离猫AD-MSCs,并用流式细胞术鉴定分离的细胞;以0、2、4、8 mmol/L GM完全培养基处理CRFK,并于12、24和48 h用CCK-8法检测细胞活性,筛选最适造模浓度;致损的CRFK分别与猫AD-MSCs及AD-MSCs-CM共培养,于24、48和72 h后用CCK-8法检测细胞增殖活性,24 h后通过Annexin V流式细胞术检测细胞凋亡率,最后通过实时荧光定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin d1,CCND1)、细胞增殖核抗原(proliferative nuclear antigen,PCNA)、Bax和Bcl-2基因的表达水平。结果显示,分离培养的猫AD-MSCs在体外培养条件下呈典型的梭型,高表达MSCs表面标记物CD44、CD90和CD105,不表达白细胞表面标记物CD45;AD-MSCs和AD-MSCs-CM均能促进GM致损CRFK的增殖并抑制其凋亡,其中AD-MSCs和AD-MSCs-CM可通过上调增殖相关基因CCND1、PCNA和抗凋亡基因Bcl-2的表达并降低促凋亡基因Bax的表达而发挥促增殖、抑凋亡作用。试验成功分离得到猫AD-MSCs,并证实AD-MSCs及其条件培养基在体外能促进GM致损CRFK的增殖和迁移,为猫AD-MSCs治疗猫急性肾损伤提供依据。

猫血清白蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

【目的】在毕赤酵母中构建猫血清白蛋白(feline serum albumin,FSA)表达系统,并探索其最适的基本表达条件,为FSA的生产提供一种新方法。【方法】在GenBank上获取FSA碱基序列,进行密码子优化并合成,将优化的密码子构建到载体pPIC9K上,经PCR和双酶切验证后通过电击转化将重组质粒FSA-pPIC9K转化毕赤酵母GS115,依次经MD平板和G418筛选后进行菌落PCR获得阳性菌株,随机选取阳性菌株经甲醇诱导表达96 h后,取表达上清液进行Western blotting验证。选取表达量较高的菌株分别在不同温度(24、26、28和30℃)、pH(4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)和甲醇诱导量(其中1组为每24 h添加0.5%,其余4组为每12 h分别添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)的条件下诱导表达96 h,取表达上清液进行Western blotting验证。【结果】菌落PCR结果显示,获得2条大小分别约为2.3和2.2 kb的目的基因条带和毕赤酵母AOX1基因扩增条带,诱导表达96 h后取表达上清液进行Western blotting验证,在70 ku左右出现特异性条带。通过基本条件优化发现该蛋白在28℃,pH为6.0且每12 h添加0.5%的甲醇条件下表达量较高。【结论】毕赤酵母GS115可稳定表达FSA。

马脐带间充质干细胞的分离培养与生物学特性研究

【目的】建立马脐带间充质干细胞(UC-MSCs)体外分离培养体系,研究其增殖能力、分化能力和生物学特性,为推广UC-MSCs在赛马运动损伤治疗方面的应用提供理论依据。【方法】采用I型胶原酶消化法从脐带组织分离马UC-MSCs,通过绘制生长曲线及计算群体倍增时间检测其体外增殖能力,结合流式细胞仪检测和RT-PCR扩增鉴定表面标志物(CD29、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105),并通过体外成脂成骨诱导分化检测其分化潜能。【结果】分离获得的原代马UC-MSCs为折光性强的圆形悬浮细胞,培养10 d后细胞融合达90%,且传代后细胞增殖速度明显提高,传代至P3代,细胞呈旋涡状生长,形态为均一的长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形。流式细胞仪检测结果显示,马UC-MSCs高表达CD29、CD44和CD90,表达率分别为98.45%、97.08%和96.56%,呈强阳性,但不表达CD45;RT-PCR扩增结果表明,马UC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs表面标志物基因,但不表达CD45基因。以胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松为主要试剂进行马UC-MSCs体外成脂诱导,诱导第10 d发现细胞内有小脂滴形成,至诱导第18 d有大量脂滴形成;选用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松为主要试剂进行体外成骨诱导,至诱导第7 d可观察到钙结节形成。【结论】采用I型胶原酶消化法分离获得的马UC-MSCs纯度高,且具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能;掌握好马UC-MSCs的有效冻存方式,可为治疗赛马运动损伤提供优质的种子细胞。

犬UC-MSC-Exo来源miRNA表达分析及其cfa-miR-34a/-143对血管内皮细胞增殖的影响

试验旨在分离鉴定犬脐带间充质干细胞分泌的外泌体(UC-MSC-Exo),并研究犬UC-MSC-Exo来源miRNA的表达情况及其对血管内皮细胞(VEC)增殖的影响。采用超高速离心法从犬脐带间充质干细胞培养上清中分离外泌体,采用Western blotting、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析法(NTA)进行鉴定。通过对犬UC-MSC-Exo中的miRNA进行测序,筛选出2个目标miRNA(cfa-miR-34a和cfa-miR-143)并合成相应的mimic和inhibitor,转染犬VEC;采用荧光显微镜和实时荧光定量PCR法检测mimic和inhibitor转染情况及其转染效率;CCK-8法检测转染mimic和inhibitor对犬VEC增殖能力的影响,并对其靶基因进行预测。结果显示,犬UC-MSC-Exo表达特异性的外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81,粒径集中在100~200 nm,电镜检测成典型的杯状。免疫荧光结果表明,miRNA mimic和inhibitor均已转染进细胞内,并且聚集于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明,转染cfa-miR-34a mimic和cfa-miR-143 mimic后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别升高约400和78倍;而转染cfa-miR-34a inhibitor和cfa-miR-143 inhibitor后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别降低了77%和83%;CCK-8检测结果表明,cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进血管内皮细胞的增殖(P<0.01)。cfa-miR-34a靶基因预测结果发现,共有195个保守靶位点,与miRDB预测结果共有69个交集靶基因;cfa-miR-143则有448个保守靶基因,其与miRDB预测结果有128个交集靶基因。本试验成功分离得到犬UC-MSC-Exo,且证实目标miRNA cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进VEC增殖。

基于线粒体12S rDNA基因对多房棘球绦虫种系发育的分析

为了探究实验室传代沙鼠的棘球蚴各地理分离株线粒体12S rDNA基因是否发生突变及其与世界各地不同来源多房棘球蚴12S rDNA之间的系统发育关系,本试验利用特异性引物扩增同一实验室相同条件传代且来源于不同地区的多房棘球蚴12S rDNA基因片段,并结合GenBank中已收录的多房棘球绦虫12S rDNA基因序列进行系统发育分析。结果显示本试验扩增、克隆的16个线粒体12S rDNA基因序列大小均为374 bp,分别属于3个单倍型(Hap_1,Hap_9,Hap_10),单倍型多态性为0.242,核苷酸多态性为0.001,与多房棘球绦虫(JAVA株)参考线粒体基因组12S rDNA基因序列相比共存在3个突变位点。单倍型地区聚类网络分析显示,在所分析的140条序列中共有10个单倍型,其中来自土耳其、中国、波兰、德国等8个国家的109条序列均与JAVA参考基因组12S rDNA基因序列为同一单倍型,来自日本和俄罗斯西伯利亚地区的13条序列为同一单倍型,来自斯洛伐克的6条序列为同一单倍型,而其他单倍型均只有1条序列。试验表明多房棘球绦虫12S rDNA基因单倍型多样性和核苷酸多样性都较低,不适于多房棘球绦虫种内遗传多态性分析。本试验结果不仅为本实验室多房棘球绦虫物种鉴定和基因型分析提供基础数据,也为今后多房棘球绦虫种内基因多态性分析时指出了不适的目的基因,为棘球绦虫的分类、鉴定、遗传变异研究提供相关依据。

不同抗氧化剂对体外保存的鸡精子活力及人工授精效果的影响

为研制适合鸡精液的高效稀释保存液,试验在前期筛选的两种效果较好配方的基础上,进行淫羊藿苷、半胱氨酸和绿原酸三种抗氧化剂的筛选,然后用筛选的稀释液进行人工授精试验。结果显示:抗氧化剂筛选试验中,添加半胱氨酸的A配方的精子保存效果最好。48 h时,A配方的精子平均活力为0.50,其精子质膜完整率和总抗氧化能力(T-AOC)浓度均显著高于其他配方(P<0.05),而精子畸形率显著低于其他配方(P<0.05)。鸡场授精试验中,稀释精液保存0 h时,3个比例稀释组的种蛋受精率、出苗率和健雏率与原精输精组无显著差异(P>0.05);8 h时,1∶3比例的种蛋受精率(83.50%)显著低于1∶1(93.60%)和1∶2(92.94%)(P<0.05),但各稀释比例的出雏率和健雏率均无明显差异(P>0.05);24 h时,各稀释比例的种蛋受精率、出雏率和健雏率均明显下降,1∶1比例组种蛋受精率显著高于1∶2和1∶3比例(P<0.05),1∶1和1∶2比例组的出雏率和健雏率均显著高于1∶3比例(P<0.05),而1∶1和1∶2比例组之间的出雏率和健雏率均无显著差异(P>0.05)。结果表明:添加半胱氨酸的A配方精子稀释液保存效果较好,使用自研稀释液与精液按1∶1和1∶2稀释比例体外保存鸡的精液,在0 h和8 h时输精可获得较好的人工授精效果。