基于含药肝孵育液法的麻黄-杏仁药对舒张支气管平滑肌的β2受体机制与效应成分验证

目的:分析麻黄-杏仁药对含药肝孵育液的解痉效应成分与效应指标之间的关联性,与分子对接及文献结果对比,进一步探讨含药肝孵育液法用于中药体外组织器官水平药理学研究的可行性。方法:采用HPLC法测定麻黄-杏仁药对含药肝孵育液中麻黄碱(X1)、伪麻黄碱(X2)、甲基麻黄碱(X3)、苦杏仁苷(X4)的含量;于乙酰胆碱和磷酸组胺预收缩的离体气管环痉挛模型,采用生物信号采集系统检测气管环张力变化,ELISA检测气管组织环磷酸腺苷(cAMP)与环磷酸鸟苷(cGMP)及二者比值变化;采用多元线性回归分析效应成分与效应指标的相关性;采用分子对接技术分析验证上述实验结果。结果:麻黄-杏仁药对能上调气管环舒张率(Y1)和cAMP/cGMP比值(Y2);以效应成分含量为自变量,效应指标变化为因变量,得回归方程分别为Y1=0.238 X1-0.105 X2+0.675 X3-0.097 X4-82.161(R2=0.961)和Y2=0.093 X1-0.056 X2+0.108 X3+0.017 X4-16.197(R2=0.999),效应成分与效应指标之间相关性较强,其对效应指标影响程度为:甲基麻黄碱>麻黄碱>伪麻黄碱>苦杏仁苷;分子对接结果表明效应成分与肾上腺素β2受体的结合程度与上述结果一致。结论:麻黄-杏仁药对含药肝孵育液用于体外支气管环的药效结果与分子对接及文献调研结果基本一致,进一步表明该方法用于中药体外组织器官水平药效学研究具有一定的可行性。

葛根与粉葛抗H9c2细胞OGD/R损伤的有效成分及作用机制初步研究

目的初步探讨葛根(Puerariae Lobatae Radix,PLR)与粉葛(Puerariae Thomsonii Radix,PTR)抗心肌细胞损伤的物质基础、作用及机制的异同;比较二者不同含药体系中有效成分相对含量及抗心肌(H9c2)细胞氧-糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤效应的差异。方法应用网络药理学方法找出PLR和PTR抗H9c2细胞OGD/R损伤的有效成分,结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)检测鉴定二者含药肠吸收液(intestinal absorption fluid,IAF)和含药血清(medicated serum,MS)中的主要有效成分及相对含量;建立H9c2细胞OGD/R损伤模型,PLR与PTR不同含药体系干预后,CCK-8检测细胞活力,生化试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞丝裂原活化蛋白激酶p38(MAPKp38)和核转录因子-κBp65(NFκBp65)蛋白表达。结果研究发现PLR和PTR抗H9c2细胞OGD/R损伤的有效成分为葛根素、滨蒿内酯、大豆素、芒柄花素、染料木素,且MS中各有效成分相对含量均远低于IAF;与正常组比较,模型组SOD活性降低(P<0.01),LDH活性升高(P<0.01),MAPKp38和NFκBp65蛋白表达增加(P<0.05);与模型组比较,各给药组均可以升高SOD活性(P<0.01),降低LDH活性(P<0.01),下调MAPKp38和NFκBp65蛋白表达(P<0.05)。比较发现,PLR抗H9c2细胞损伤的作用优于PTR;IAF对各药效指标的影响优于MS。结论PLR和PTR均可不同程度的保护OGD/R引起的H9c2细胞损伤,而PLR的作用较强,其作用机制可能是通过调控MAPKp38和NFκBp65蛋白表达发挥作用;IAF中有效成分相对含量较高,对各药效指标影响的较强而重现性较好,适合于中药体外药理学研究。

麻杏石甘汤含药肝孵育液对大鼠气道上皮细胞损伤的保护作用研究

目的探讨麻杏石甘汤含药肝孵育液对大鼠气道上皮细胞损伤的保护作用。方法按照麻黄-甘草三个配比(1∶4、4∶1、1∶1)制备麻杏石甘汤药液,通过外翻肠囊法、肝细胞短暂孵育分别制备含药肝孵育液A、B和C;以磷酸组胺复制气道上皮细胞损伤模型;造模后细胞分为模型组(完全培养基)、阳性对照组(200μmol·L^(-1)地塞米松)和实验A、B和C组(含药肝孵育液A、B和C),另取正常大鼠气道上皮细胞作为空白对照组。用流式细胞术检测总凋亡率,用荧光素DCFH-DA探针法测定细胞内活性氧(ROS)含量,用蛋白质印迹(Western blot)法检测上皮细胞表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)蛋白的表达水平。结果空白对照组、模型组、阳性对照组和实验A、B、C组的细胞凋亡率分别为(21.29±0.94)%、(30.59±1.55)%、(23.16±1.76)%、(18.87±5.94)%、(17.93±5.26)%和(16.75±2.06)%,细胞内活性氧(ROS)水平分别为1.00±0.06、1.84±0.26、0.97±0.13、0.86±0.23、0.92±0.05和1.07±0.14,EGFR蛋白相对表达水平分别为0.69±0.04、1.01±0.10、0.48±0.01、0.57±0.16、0.30±0.07和0.34±0.05,PI3K蛋白相对表达水平分别为0.38±0.01、0.59±0.01、0.40±0.01、0.35±0.15、0.14±0.01和0.20±0.04;实验A、B和C组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论麻杏石甘汤含药肝孵育液可能通过降低细胞活性氧水平,抑制细胞凋亡,调控EGFR/PI3K蛋白的表达,从而达到减轻气道上皮细胞损伤的作用。

麻杏石甘汤对哮喘模型大鼠气道损伤及EGFR表达的影响

目的:探讨麻杏石甘汤调节表皮生长因子受体(EGFR)表达、减轻大鼠气道损伤的作用,并找出其治疗哮喘较优的配伍比例。方法:SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(5×10^(-4)g·kg^(-1))及麻杏石甘汤1∶0.5、1∶1、1∶2组(中药A、B、C组,剂量均为10 g·kg^(-1)),每组8只,除正常组外,其余各组用2%氯化乙酰胆碱与0.4%磷酸组胺雾化复制哮喘模型,造模前1 h,正常组和模型组大鼠灌服等体积生理盐水,其余各给药组灌服等体积相应药物,1次/d,连续7 d。第7天造模并记录引喘潜伏期后即刻麻醉,取动脉血和气管组织。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,病理切片观察各组气管组织病理形态变化及上皮细胞超微结构,原位末端标记法(TUNEL)检测上皮细胞凋亡,原位杂交和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测EGFR mRNA和蛋白表达。结果:与模型组比较,中药A、B、C组均可延长哮喘大鼠引喘潜伏期(P<0.05,P<0.01)。与正常组比较,模型组大鼠IL-2水平显著降低(P<0.01),IL-4和TNF-α水平明显升高(P<0.05,P<0.01),气道病理学评分、蓝色胶原面积和气道上皮细胞凋亡指数均显著升高(P<0.01),气管组织EGFR mRNA和蛋白的表达均显著增高(P<0.01);与模型组比较,中药A组IL-2水平明显升高(P<0.05);中药A、B组IL-4水平明显降低(P<0.05,P<0.01);中药A、B、C组TNF-α水平均显著降低(P<0.01);中药A、B、C组对气管组织病理改变有不同程度的修复作用(P<0.05),中药A组可以抑制气管组织纤维化(P<0.05),且中药A组对气道上皮细胞超微结构变化的修复作用最为显著;中药A、B、C组可明显抑制气道上皮细胞的凋亡(P<0.05);中药A、B、C组均可明显抑制EGFR mRNA的过表达(P<0.05,P<0.01),中药B、C组可显著抑制气道上皮组织EGFR蛋白上调(P<0.05,P<0.01)。结论:麻杏石甘汤可以抑制哮喘模型大鼠气道上皮细胞凋亡及其结构的异常改变,减轻气道损伤,降低气管组织中EGFR的表达。麻杏石甘汤减轻哮喘大鼠气道上皮损伤的较优配伍组是中药A组,其比例为麻黄-苦杏仁-甘草-石膏1∶0.5∶4∶1。

基于差异性成分分析的麻杏石甘汤含药肝孵育液体外药效学初步研究

目的:以含药血清为对照,通过检测分析麻杏石甘汤(Maxing Shigan Decoction, MSD)含药肝孵育液的显著性差异成分及其含量、变异系数,为含药肝孵育液的质量控制提供参考,初步探讨其用于MSD体外药效学研究的可行性。方法:应用三重四级杆液-质联用(TSQ-Quantis)技术,采集13组MSD水煎液数据,采用正交偏最小二乘判别分析法分析得到水煎液的差异性成分;采集不同批次MSD含药肝孵育液和含药血清数据,找到二者的差异性成分,计算各成分的含量并分析其RSD。体外药效学实验分为正常组、模型组、含药肝孵育液(2.5%,5%,10%)和含药血清(2.5%,5%,10%)组,用磷酸组胺处理复制支气管上皮细胞损伤模型,分别给予相应药物孵育36 h后,Western blot检测各组磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)蛋白的相对表达量,并计算RSD。结果:与水煎液的8个差异性成分相比,含药肝孵育液和含药血清的差异性成分均有7个;含药肝孵育液中差异性成分的含量高,且不同批次间各成分的RSD均小于10%。含药肝孵育液组和含药血清组(2.5%)PI3K蛋白表达降低(P<0.05),含药肝孵育液和含药血清组Akt蛋白的表达均显著降低(P<0.05),且各含药肝孵育液组PI3K和Akt相对表达量的RSD均小于10%。结论:MSD含药肝孵育液中的差异性成分近似于含药血清,该体系成分含量高、稳定性好;对上皮细胞损伤模型PI3K和Akt蛋白表达的作用趋势与含药血清一致,且结果重现性好;结合其模拟口服中药肠吸收后经肝入血的全过程等优点,初步表明含药肝孵育液用于MSD体外药效学研究有一定的可行性。

基于含药肝孵育液法的麻杏石甘汤抗气道上皮损伤的作用机制研究

目的结合体内外实验探讨含药肝孵育液法用于中药体外药理学研究的可行性及麻杏石甘汤抗气道上皮损伤的作用机制。方法SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(dexamethasone,Dex)及麻杏石甘汤组(中药配比方A、B、C、D),麻杏石甘汤干预大鼠哮喘模型,记录引喘潜伏期,病理切片观察气管组织病理形态和气道上皮细胞超微结构变化,原位杂交和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测表皮生长因子受体(EGFR)mRNA和蛋白表达;SD雄性大鼠离体气管随机分为正常组、模型组、布地奈德福莫特罗组(budesonide and formoterol fumarate powder for inhalation,BF)及麻杏石甘汤含药肝孵育液组(中药配比方A、B、C、D),麻杏石甘汤含药肝孵育液干预大鼠离体气管损伤模型,记录气管张力变化,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测气管EGFR、血管内皮生长因子(VEGF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)含量水平,原位杂交和免疫组化分别检测磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)mRNA和蛋白表达;大鼠气道上皮细胞(RTE)随机分为正常组、模型组、地塞米松组及麻杏石甘汤含药肝孵育液组(中药配比方A、B、C、D),麻杏石甘汤含药肝孵育液干预RTE细胞损伤模型,流式细胞术检测RTE细胞损伤率,Western blot检测RTE细胞EGFR、PI3K蛋白表达。结果整体研究表明,与正常组比较,模型组气管组织EGFR mRNA和蛋白表达显著升高,气管组织结构形态和上皮细胞超微结构受损;与模型组比较,给药组均可延长大鼠引喘潜伏期,修复气管组织结构形态和上皮细胞超微结构损伤,并下调EGFR mRNA和蛋白表达,以A组药效最为显著。离体组织研究表明,与正常组比较,模型组气管EGFR、VEGF、GM-CSF含量水平显著升高,PI3KmRNA和蛋白表达显著升高;与模型组比较,给药组均可舒张气管环张力,降低EGFR、VEGF、GM-CSF含量水平,并下调PI3K mRNA和蛋白的表达,以A组药效最为显著。离体细胞研究表明,与正常组比较,模型组RTE细胞损伤率显著增加,EGFR、PI3K蛋白表达显著升高;与模型组比较,给药组均可降低RTE细胞损伤,下调EGFR、PI3K蛋白表达,以A组药效最为显著。结论含药肝孵育液法用于体外药理学研究对各药效指标影响的作用趋势与体内药理作用相一致,具备较好的可行性;麻杏石甘汤减轻气道上皮损伤可能是通过调节EGFR/PI3K信号通路和抑制气道重塑发挥作用。

麻杏石甘汤含药肝孵育液的制备工艺及疗喘主要差异性成分研究

目的考察麻杏石甘汤(MXSGT)含药肝孵育液较优的制备工艺条件,并通过液质联用分析探讨其疗喘主要差异性成分,为该方法用于体外药理学研究提供支撑。方法选用L_(9)(3^(4))正交表,将肝细胞密度(A)、肝细胞悬液-含药肠吸收液体积比(B)、孵育时间(C)作为3因素,各取3水平,采用HPLC检测MXSGT含药肝孵育液9个实验组中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸铵的含量,得出较优制备条件。应用三重四级杆液质联用仪(TSQ-Quantis)技术,采用Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),柱温40℃,流动相0.05%甲酸水-乙腈梯度洗脱,电喷雾离子源,正离子模式(ESI^(+))和负离子模式(ESI^(-))扫描,采集MXSGT含药肝孵育液质谱图数据,PLS分析找出其疗喘主要差异性成分。结果当BRL-3A细胞密度为1×10^(5)个/mL、细胞悬液:含药肠吸收液=1:12、孵育时间为10 min时,4种成分含量均最高,可选为含药肝孵育液的制备工艺条件。MXSGT含药肝孵育液中主要差异性疗喘化合物为甲基麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草素、甘草酸铵7种。结论建立的含药肝孵育液制备工艺简便准确、重复性好、专属性强,可为后续的体外药理作用及机制研究提供新的方法;基本明确了MXSGT口服后通过肠吸收由门静脉经肝入血的物质基础,可为深入地成分-靶点分析乃至复方配伍规律研究提供依据。