猪多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增检测方法的建立

为建立猪多杀性巴氏杆菌(Pm)的快速检测方法,本研究以Pm的Plp B基因序列为靶基因设计特异性引物,建立了Pm特异性的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。经反应条件优化,确定反应条件为63℃,20 min。检测结果显示,建立的LAMP检测方法具有良好的特异性,灵敏度为25 cfu/m L;与大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌无任何交叉反应。采用建立的LAMP方法与常规PCR方法对临床54份分离样品进行检测,检测结果为31份为阳性,23份为阴性,二者符合率为100%。该方法的建立为Pm在临床上的快速检测提供了一种新的技术手段。

猪源多杀性巴氏杆菌脂蛋白B基因的生物信息学分析与原核表达

目的原核表达猪源多杀性巴氏杆菌脂蛋白B(Pasteurella lipoprotein B,PlpB)基因,并进行生物信息学分析。方法采用PCR法从猪源多杀性巴氏杆菌CVCC446株(B∶2型)中扩增PlpB基因,克隆入含GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒,测序后,利用生物信息学方法对测序结果进行同源比对,分析其蛋白质的一级结构、二级结构及三级结构,并在三级结构的基础上进行同源建模。将重组表达质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,透析法纯化重组GST-PlpB蛋白,Western blot法分析其反应原性。结果重组表达质粒经酶切鉴定证明构建正确。PlpB基因全长771 bp,编码257个氨基酸残基。生物信息学分析显示,PlpB蛋白是一个具有较高同源性的脂蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主要构件,其空间结构与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的免疫原性脂蛋白A(3K2D_A)相似性较高,以此为模板,成功构建了可靠的三维结构分子模型。表达的重组GST-PlpB蛋白相对分子质量约为56 000,主要以可溶性形式存在;纯化的重组GST-PlpB蛋白可见相对分子质量约56 000的单一条带;该蛋白具有良好的反应原性。结论成功从猪源多杀性巴氏杆菌CVCC446株(B∶2型)中扩增出PlpB基因,利用生物信息学方法,结合网络数据库,对PlpB蛋白进行了预测,构建了可靠的三维结构模型,并在大肠埃希菌中表达了重组GST-PlpB蛋白,为进一步研究PlpB的功能、特征及疫苗的研制奠定了基础。

猪B型多杀性巴氏杆菌铁摄取调节基因Fur的生物信息分析及其原核表达

目的对猪B型多杀性巴氏杆菌铁摄取调节基因Fur进行生物信息分析,并检测原核表达产物的抗原性。方法以猪B型多杀性巴氏杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增Fur基因,克隆至载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-Fur。利用生物信息学方法结合网络数据库测序分析Fur基因同源性、蛋白质理化特性、蛋白质结构并进行同源建模。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经透析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒p GEX-6p-1-Fur经双酶切鉴定构建正确。Fur基因全长432 bp,编码144个氨基酸,与禽Pm70菌株的Fur基因同源性达99.8%,与嗜血杆菌属亲缘较近;Fur蛋白空间结构与铁吸收调节蛋白2w57.1.A相似性较高,Fur蛋白为酸性脂蛋白,Fur蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,107-117位氨基酸区域作为抗原表位可能性较大,且Fur无跨膜区与信号肽,是相对成熟稳定的蛋白。以2w57.1.A为模板构建了可靠的三维结构分子模型。重组蛋白GST-Fur相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的33%,纯化后纯度达92%,重组蛋白GST-Fur可与多杀性巴氏杆菌制备的血清发生特异性结合。结论于E.coli中成功表达了重组蛋白GST-Fur,构建了可靠的三维结构模型,为进一步研究Fur蛋白功能及毒力作用机制奠定了基础。