外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制

目的探讨外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制。方法采用实验研究方法。将15只6~8周龄雌性SD大鼠按随机数字表法(分组方法下同)分为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组,每组5只,单纯烫伤组和烫伤+肉碱组大鼠背部制作30%体表总面积的Ⅲ度烫伤,其中烫伤+肉碱组大鼠另外给予腹腔注射左旋肉碱。伤后72 h,采用全自动生化仪检测肝损伤生物化学指标天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平,样本数为5。伤后72 h,采用苏木精-伊红染色观察肝组织损伤情况。伤后72 h,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)法检测肝组织中细胞焦亡相关标志物核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、消皮素D和白细胞介素1β(IL-1β)以及内质网应激相关标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA水平;采用蛋白质印迹法检测肝组织中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平,样本数均为5。取人肝癌细胞HepG2,分为二甲基亚砜(DMSO)组、0.1μmol/L衣霉素组、0.2μmol/L衣霉素组、0.4μmol/L衣霉素组、0.8μmol/L衣霉素组,分别作相应处理。培养24 h后,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞活力并筛选衣霉素干预浓度(样本数为5)。取HepG2人肝癌细胞,分为DMSO组、单纯衣霉素组和衣霉素+肉碱组,分别作相应处理。培养24 h后,采用蛋白质印迹法检测细胞中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平,样本数均为3。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。结果伤后72 h,单纯烫伤组大鼠血清中AST和ALT水平分别为(640±22)、(157±8)U/L,均分别明显高于假伤组的(106±13)、(42±6)U/L(t值分别为-46.78、-25.98,P<0.01);烫伤+肉碱组大鼠血清中AST和ALT水平分别为(519±50)、(121±10)U/L,均明显低于单纯烫伤组(t值分别为4.93、6.06,P<0.01)。伤后72 h,假伤组大鼠肝组织形态基本正常,未见明显的炎症细胞浸润;与假伤组相比,单纯烫伤组大鼠肝组织可见大量的炎症细胞浸润,细胞排列紊乱;与单纯烫伤组相比,烫伤+肉碱组大鼠肝组织可见少量的炎症细胞浸润。伤后72 h,单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1βmRNA表达水平均明显高于假伤组(t值分别为34.42、41.93、30.17、15.68,P<0.01);烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1βmRNA表达水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为34.40、37.20、19.95、7.88,P<0.01)。伤后72 h,与假伤组相比,单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显升高(t值分别为12.28、26.92、5.20、10.02、24.78,P<0.01);与单纯烫伤组相比,烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显下降(t值分别为10.99、27.96、12.69、8.96、12.27,P<0.01)。伤后72 h,单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显高于假伤组(t值分别为21.00、16.52,P<0.01),烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为8.92、8.21,P<0.01);单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显高于假伤组(t值分别为22.50、14.29,P<0.01),烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为14.29、5.33,P<0.01)。培养24 h后,与DMSO组相比,0.1μmol/L衣霉素组、0.2μmol/L衣霉素组、0.4μmol/L衣霉素组、0.8μmol/L衣霉素组细胞存活率均明显下降(t值分别为4.90、9.35、18.64、25.09,P<0.01);选择0.8μmol/L作为后续衣霉素的干预浓度。培养24 h后,与DMSO组相比,单纯衣霉素组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显升高(t值分别为10.48、17.67,P<0.01);与单纯衣霉素组相比,衣霉素+肉碱组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显下降(t值分别为8.08、13.23,P<0.05或P<0.01)。培养24 h后,与DMSO组相比,单纯衣霉素组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显升高(t值分别为13.44、27.51,P<0.01),caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);与单纯衣霉素组相比,衣霉素+肉碱组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显下降(t值分别为20.49、21.95,P<0.01),caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05)。结论在严重烫伤大鼠中,外源性左旋肉碱可能通过抑制过度内质网应激介导的细胞焦亡相关通路发挥对肝损伤的保护作用。

甘草酸二铵对严重烫伤大鼠肝损伤的影响及其机制

目的探讨甘草酸二铵对严重烫伤大鼠肝损伤的影响及其机制。方法采用实验研究方法。取54只7~9周龄雌性SD大鼠,按随机数字表法分为背部模拟致伤的假伤组及背部造成30%体表总面积Ⅲ度烫伤的单纯烫伤组及烫伤+甘草酸二铵组,每组18只。假伤组伤后不行特殊处理;单纯烫伤组及烫伤+甘草酸二铵组大鼠进行补液抗休克,烫伤+甘草酸二铵组大鼠分别于伤后1、25、49 h经腹腔注射50 mg/kg甘草酸二铵溶液。取3组大鼠,伤后24、48、72 h,采用全自动生化检测分析仪检测血清肝功能损伤相关指标天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白、白蛋白含量,采用酶联免疫吸附测定法检测血清鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OCT)含量;行苏木精-伊红染色观察伤后72 h肝组织病理学变化;采用实时荧光定量反转录PCR法检测伤后24、48、72 h肝组织B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录激活因子4(ATF4)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)的mRNA表达。采用蛋白质印迹法检测假伤组伤后72 h及烫伤2组伤后24、48、72 h肝组织Bcl-2、Bax、GRP78、PERK、ATF4的蛋白表达。各组各时间点样本数均为6。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析及Bonferroni检验。结果与假伤组比较,单纯烫伤组大鼠伤后各时间点血清中AST、ALT、LDH含量均明显升高(P<0.01),总蛋白、白蛋白含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)。相较于单纯烫伤组,烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后24 h血清中AST含量明显下降(P<0.05);烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h血清中AST、ALT、LDH含量均明显下降(P<0.01),总蛋白含量明显升高(P<0.01);烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后72 h血清中AST、ALT、LDH含量均明显下降(P<0.01),总蛋白和白蛋白含量均明显升高(P<0.01)。伤后24、48、72 h,单纯烫伤组大鼠血清OCT含量分别为(48.5±3.9)、(40.8±2.4)、(38.7±2.0)U/L,均明显高于假伤组的(15.1±2.5)、(15.7±2.6)、(16.4±3.7)U/L(P<0.01)和烫伤+甘草酸二铵组的(39.0±4.5)、(31.8±2.0)、(22.1±2.6)U/L(P<0.05或P<0.01)。伤后72 h,假伤组大鼠肝组织中细胞形态正常,排列规则,未见明显炎症细胞浸润;单纯烫伤组大鼠肝组织中细胞排列紊乱,伴有弥漫性的脂肪病变和中等量炎症细胞浸润;烫伤+甘草酸二铵组大鼠肝组织中细胞排列较规则,可见散在的脂肪变性,伴有少量炎症细胞浸润。与假伤组比较,单纯烫伤组大鼠伤后24、48、72 h肝组织Bcl-2 mRNA(P<0.05或P<0.01)和蛋白表达均明显减少,Bax的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显增加。与单纯烫伤组比较,烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h肝组织Bax的mRNA(P<0.05)和蛋白表达均明显减少;烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后72 h肝组织Bax的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显减少,Bcl-2的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显增加。与假伤组比较,单纯烫伤组大鼠伤后各时间点肝组织ATF4、GRP78、PERK的mRNA(P<0.05或P<0.01)和蛋白表达均明显增加。与单纯烫伤组相比,烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h肝组织ATF4的mRNA(P<0.01)和蛋白表达均明显减少,伤后72 h肝组织ATF4、GRP78、PERK的mRNA(P<0.05或P<0.01)和蛋白表达均明显减少。结论甘草酸二铵能有效降低严重烫伤后大鼠肝损伤的程度,其机制可能是通过缓解内质网应激及减轻线粒体损伤。