现场分割奶牛胚胎产生同胚双犊的研究

采用简易徒手胚胎分割法,一分为二分割奶牛胚胎。应用非手术方法,每头受体移植成对二分胚。移植4头受体,2头妊娠,其中1头产公犊1头,1头产母犊2头。该母犊为同胚双犊,健康,发育正常。

汉白猪同期发情和超数排卵的研究

猪发情周期第13～15d,肌注PGF_(2)和肌注FSH+PGF_(2)进行同期发情处理。两组分别于注射后57.23±12.15h(n=13)和62.06±11.95h(n=17)发情,同期化都在±1d内,两组间差异不显著。用FSH+PGF_(2)+hcG方法超数排卵,FSH总剂量分别为440和360IU。两组头均采卵数为35.00±28.02枚(n=4);而总剂量 200IU组仅为4.00±1.41枚(n=2)。未进行超数排卵处理,而是自然发情配种的,头均采卵数为6.88±4.02枚(n=8)。第一次配种后18～30h(26.33±4.04)采卵为原核期卵。

原始生殖细胞的人类胚胎干细胞克隆

取材于妊娠终止胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织，用ＤＭＥＭ＋ＮＣＳ培养液体外培养，分离由人ＰＧＣｓ转化成的类ＥＳ细胞，并将其与同源胚胎成纤维细胞一起用胰蛋白酶＋ＥＤＴＡ的无钙镁ＰＢＳ液消化传代。在原代培养１２ｈ观察到胞体较大、边缘不整、贴壁分裂增殖的ＰＧＣｓ样细胞，４８ｈ后观察到２６处紧密排列呈鸟巢状的类ＥＳ细胞集落及集落团。第６ｄ传代成功，第１６ｄ传至第４代。结果表明，体外培养附植后胚胎能够建成人的类ＥＳ细胞系。

由猪囊胚内细胞团分离胚胎干细胞的研究

以 PMEF为饲养层培养猪 7～ 9日龄囊胚分离 ES细胞 ,ICM初次传代时间为 4～ 7d,ES细胞传代时间为 4～ 5 d,ES细胞传至 1～ 5代的胚胎数分别为 1 2 (1 8.8% ) ,8(1 2 .5 % ) ,5 (7.8% ) ,3(4 .7% ) ,2 (3.1 % ) ,并进行体外分化和 AKP染色鉴定。对影响猪 ES细胞分离与克隆的因素进行比较 ,结果表明 :(1 ) 9和 1 4日龄小鼠胎儿 PMEF饲养层培养 9日龄猪囊胚 ,贴壁率 (83.3% ,88,9% ) ,ICM形成率 (75 .0 % ,77.8% )和 1代 ES细胞克隆率(2 5 .0 % ,2 2 .2 % )无显著性差异 (P>0 .0 5 )。 (2 ) 7,8和 9日龄胚胎随胚龄增加 ,胚胎贴壁率 (5 .9% ,5 7.1 % ,87,9% )和 ICM形成率 (0 .0 % ,2 8.6 % ,81 .8% )升高 ,差异显著 (P<0 .0 1 )。(3) 9日龄囊胚直径 0 .8～ 1 .2 m m培养36～ 4 8h贴壁 ,贴壁率 1 0 0 % ,ICM形成率 1 0 0 % ;直径 >1 .2 mm囊胚贴壁时间为 4 8～ 72 h,贴壁率 5 7.1 % ,ICM形成率 5 7.1 % ,差异显著 (P<0 .0 5 )。去除直径 >1 .2 m m囊胚部分滋养层细胞培养 36～ 4 8h,贴壁率 91 .7% ,ICM形成率 83.3% ;(4 )添加外源 L IF没有提高贴壁率 (86 .4 % ,90 .9% ;P>0 .0 5 )和 ICM形成率 (81 .8% ,81 .8% ;P>0 .0 5 )

奶牛胚胎一分为四分割移植试验

1990年7月至1991年3月,以非手术方法采得黑白花奶牛7日龄胚胎。在立体显微镜下,应用徒手简易胚胎分割法,一分为四分割6枚胚胎。将所分割的24枚1/4裸胚,以非手术方法,分别移植给18头受体牛。其中9头妊娠,受体移植妊娠率为50％(9/18),胚胎移植妊娠率为150％(9/6)。得到同胚三犊一组,同胚二胎一组(其中一头产犊,一头流产)和单胎四个(其中两头产犊,两头流产)。

奶牛胚胎直接投入液氮冷冻保存试验

将奶牛7日龄胚胎,常温下在含128.9g/L甘油PBSS肉孵育20min后移入193.2g/L甘油+85.6g/L蔗糖PBSS内孵育7min,装管后即投入液氮内冷冻保存。182d后解冻8枚,用含342.3g/L蔗糖PBSS脱去甘油,7枚可供移植用,胚胎可用率为87.5％(7/8),移植给7头受体牛,3头妊娠,妊娠率为42.9％。

自制简易胚胎冷冻器冷冻奶牛胚胎试验

用FSH+PGF_(2)超排黑白花奶牛,以非手术方法采得7日龄早期胚胎。应用含10％甘油卵细胞培养液作为胚胎冷冻保护液,采用自制简易胚胎冷冻器冷冻,在-196℃液氮中保存。冻胚在35℃水浴中解冻,应用92.1g/L甘油+171.2g/L蔗糖PBSS,46g/L甘油+171.2g/L蔗糖PBSS和171.2g/L蔗糖PBSS三步脱去甘油,用含20％犊牛血清PBS将胚胎清洗2遍后装管移植。共解冻18枝冻胚,16枚可用。可用胚率为84.2％(16/18)。采用非手术方法移植16头受体牛,5头妊娠产犊,移植妊娠率为31.5％(5/16)。

奶牛胚胎一步冷冻保存的研究

用ＦＳＨ－ＰＧＦ＿（２α）超排黑白花奶牛２２头，以非手术方法采得７～８日龄胚胎６８枚，其中４５枚胚胎用于一步冷冻试验。水浴解冻后共回收４０枚胚胎。用１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖一步除去保护剂，胚胎形态完好率为９０％（３６／４０）；荧光染色阳性率为８７．５％（７／８）；体外培养发育率为７５％（６／８）；冻胚移植受体妊娠率为４３．５％（１０／２３）。

小鼠胚胎直接投入液氮冷冻保存试验

室温下,将292枚小鼠胚胎在含128.9g/L甘油PBSS(含20％犊牛血清的磷酸盐缓冲液)和含193.2g/L甘油+85.6g/L蔗糖PBSS内分别孵育片刻,装管后直接投入液氮冷冻保存。冻胚快速解冻后,用含342.3g/L蔗糖PBSS脱去甘油,用PBSS清洗后镜下观察评定,胚胎回收率为86.9％(254/292),胚胎形态正常率为77.1％(196/254)。其中部分桑椹胚经体外培养,囊胚发育率为71.4％(20/28)。将110枚冻胚移植给7只受体,3只妊娠,产仔12只(5,7),妊娠率为43％(3/7),产仔率为10.9％(12/110),其中囊胚移植1只受体妊娠产仔3只,产仔率为25％(3/12)。

通过阴道穹窿移植奶牛胚胎试验

采用改造的日本产FHK奶牛胚胎移植器械,用长针头穿过奶牛阴道穹窿将胚胎注入子宫角。此法移植2头受体,2头妊娠产犊。这种方法在受体牛子宫颈特别细小、紧缩,胚胎移植管不能插入,不能进行非手术方法移植时可采用。较开腹的外科手术方法简便、快速和安全,亦可无数次地反复采用。

牛超排技术的研究

用４组药物组合：（１）ＰＭＳＧ＋ＰＧＦ２ａ；（２）ＰＭＳＧ＋ＰＧＦ２ａ＋激光照射；（３）ＦＳＨ＋ＰＧＦ２ａ；（４）ＦＳＨ＋Ｃｔｏｐｒｏｓｔｅｎｏｌ，超排处理３２２头次供体牛。共采卵１６６３枚（头均５．８１±４．６８），可用胚胎９８０枚（头均３．４３±３．９４，占５８．９％）。（３）、（４）两组胚胎可用率及可用胚胎数高于（１）、（２）组（ｐ＜０．０５）；黄牛胚胎可用率高于奶牛（ｐ＜０．０１）；育成牛胚胎可用率高于经产牛（ｐ＜０．０１）；供体牛前两次超排效果更好（ｐ＜０．０５）。

家兔微注射基因胚胎自体移植和异体移植的比较试验

冲取３２只超排或自然发情配种的母兔早期胚胎４２７枚，选其中导入抗猪瘟Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因后的３４７枚优质胚胎分组移植不同受体。第一组将９３枚微注射卵移植到７只冲卵后的洪体输卵管内，６只妊娠并产仔３２只。经ＰＣＲ检测３２只仔兔中有２只整合了外源基因。第二组将２５４枚微注射卵移植异体受体１３只，妊娠６只并产仔２０只。经ＰＣＲ检测２０只仔兔中有２只整合了外源基因。

布尔山羊胚胎移植技术的研究与应用

1999年 10～ 11月份 ,分三批使用阴道栓 +FSH超数排卵供体布尔山羊 (Boergoat,下同 ) 13只。在放入阴道栓的第 8～ 10天 ,连续三天递减量肌肉注射FSH (澳大利亚 ) 32 0mg。 9只供体羊发情、配种、采胚 (有效率 6 9 2 3% ,9/ 13) ,平均采胚数 18 11枚± 5 18枚 ,其中可用胚平均数 15 4 4枚± 6 31枚 (可用胚率 85 2 8% ,139/ 16 3)。将 139枚 7日龄可用胚移植受体关中奶山羊 89只 ,妊娠 5 0只 ,妊娠率 5 6 18%。其中鲜胚移植妊娠率 6 1 11% (4 4/ 72 ) ,冻胚移植妊娠率 4 1 6 7% (5 /12 ) ,二分割胚移植妊娠率 2 0 % (1/ 5 )。 5 0只妊娠受体羊共产羔 6 8只 ,每只供体羊平均获羔羊 7 5 6只。供体羊采胚后 ,平均 39 9天发情 ,配种 ,全部妊娠产羔 ,平均产羔 2只。胚胎移植羔羊性别、初生重、发病率和布尔羊自繁羔羊无显著差异 ,P >0 0 5。本次布尔山羊胚胎移植产生明显的经济效益 ,技术成熟 ,可推广应用 ,逐步产业化。

人胰腺干细胞建系及移植诱导胰岛治疗大鼠糖尿病

供体不足已成为移植胰岛治疗Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的主要障碍,分离克隆胰腺干细胞作为种子细胞并诱导其分化为功能性胰岛可提供丰富的移植资源.本研究从人流产胎儿胰腺组织分离获得1例单克隆胰腺干细胞系.无菌取流产胎儿胰腺组织,0.1%Ⅳ型胶原酶消化分离为单个细胞和细胞团.低糖DMEM+10%FBS培养,单个细胞和细胞团贴壁,原代上皮样胰腺干细胞克隆性生长.0.25%胰蛋白酶+0.04%已二胺四乙酸(EDTA)消化传代,成纤维样细胞和其他细胞逐渐被消除,上皮样胰腺干细胞逐渐被纯化.克隆环筛选,获得单克隆人胰腺干细胞.在培养液中添加10ng/mL表皮生长因子(EGF),单克隆人胰腺干细胞快速生长至单层,呈铺路石样.继续传代培养,1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺干细胞已传50代.液氮冷冻保存细胞1×109个以上.染色体核型分析,该干细胞系为正常的二倍体细胞.免疫组织化学反应,共表达pdx1,glucagon,nestin及CK19蛋白,不表达insulin,CD34,CD44及CD45.RT-PCR检测,转录pdx1,glucagon,nestin及CK19的mRNA,不转录insulin.β-巯基乙醇诱导,分化为神经细胞,免疫组织化学反应表达NF蛋白.烟酰胺诱导,分化为DTZ染色阳性,转录表达insulin,分泌insulin和C肽的功能性类胰岛.将单克隆人胰腺干细胞体外诱导胰岛移植在STZ制备的糖尿病大鼠肾囊内,能降低糖尿病大鼠血糖水平,延长寿命.