没药甾酮通过调控mTOR/自噬通路增强替莫唑胺抗脑胶质瘤的作用研究

目的:探讨没药甾酮增强化疗药物替莫唑胺抗脑胶质瘤的作用及其分子机制。方法:用没药甾酮、替莫唑胺单药及其联合处理U251细胞后,采用平板克隆形成实验、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)实验检测各组细胞增殖能力;采用Transwell小室实验、划痕愈合实验检测各组细胞侵袭、迁移能力;采用Western Blot检测细胞中mTOR/自噬通路关键蛋白的表达水平。结果:低氧条件下(200μmol/L的CoCl2诱导48 h),没药甾酮单药(10、30、100μmol/L)和替莫唑胺单药(6.25、12.5、25μmol/L)能显著抑制U251细胞克隆形成数(P<0.001);与替莫唑胺单药组(6.25、12.5μmol/L)比较,没药甾酮(10μmol/L)联合替莫唑胺(6.25、12.5μmol/L)抑制U251细胞克隆形成的作用增强,但差异无统计学意义(P>0.05)。没药甾酮单药(10、30、100μmol/L)和替莫唑胺单药(100、200、400μmol/L)显著下调了U251细胞EdU阳性细胞率;与替莫唑胺单药组(200、400μmol/L)比较,没药甾酮(30、100μmol/L)联合替莫唑胺(200、400μmol/L)显著下调了U251细胞EdU阳性细胞率(P<0.05或P<0.01)。与替莫唑胺单药(400μmol/L)比较,联用没药甾酮(30μmol/L)显著抑制U251细胞迁移、侵袭能力(P<0.001)。与替莫唑胺单药(400μmol/L)比较,联用没药甾酮(30μmol/L)显著下调U251细胞中Phospho-mTOR(Ser2448)、Phospho-4E-BP1(Ser65)蛋白表达,显著上调MAPKAP1、p-P70(S6K)蛋白表达(P<0.05或P<0.01),对mTOR、Phospho-mTOR(Ser2481)、Rictor、Raptor、GβL表达的下调也有一定的增强作用,但差异无统计学意义。与替莫唑胺单药(400μmol/L)比较,联用没药甾酮(30μmol/L)显著上调U251细胞中自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62的表达(P<0.05~P<0.001),对Atg12-5/free-Atg12也有上调作用,但差异无统计学意义。结论:没药甾酮可通过调控mTOR/自噬信号通路增强替莫唑胺抗脑胶质瘤作用。

基于HPLC-Q-TOF-MS/MS、网络药理学及实验验证探讨西黄丸含药血清抗脑胶质瘤的潜在活性成分及作用机制

基于高效液相色谱−四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS/MS)技术对西黄丸的入血成分进行定性分析,采用网络药理学对入血成分抗脑胶质瘤的潜在作用机制进行探究,并通过分子对接和实验验证其具体机制。大鼠灌胃给予西黄丸后收集血清,根据色谱峰保留时间、精确分子质量、特征碎片离子,结合对照品及文献数据,鉴定西黄丸含药血清的化学成分;通过PharmMapper数据库和SwissTarget Prediction数据库获得成分靶点,通过GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD、DrugBank数据库获得脑胶质瘤疾病靶点,利用Cytoscape3.9.1软件构建“成分−靶点”网络关系图;以STRING数据库构建蛋白质互作(PPI)网络关系图并对靶点进行GO分析和KEGG分析;利用分子对接验证核心靶点与相对应的入血成分的结合能力;CCK-8、Western blot验证西黄丸含药血清中代表性成分11-羰基-β-乳香酸(KBA)抗脑胶质瘤的潜在作用机制。结果共鉴定出入血成分40个(原型成分28个,代谢产物12个)。网络药理学结果显示,β-榄香酮酸、3-乙酰基-β-乳香酸、KBA、α-乳香酸等9个成分可能是西黄丸含药血清抗脑胶质瘤的活性成分,其中谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GSR)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)、ATP柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACLY)、醛酮还原酶1成员B1(AKR1B1)、谷氧还蛋白(glutaredoxin,GLRX)为关键靶点,涉及谷胱甘肽代谢(glutathione metabolism)通路、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)等。进一步细胞实验结果表明,KBA显著抑制T98G细胞增殖(IC50为30.96μmol·L^(-1)),KBA(30μmol·L^(-1))显著下调T98G细胞中GSR蛋白表达水平。综上所述,西黄丸含药血清可能通过调控谷胱甘肽代谢通路相关靶点GSR和G6PD抗脑胶质瘤。研究结果可进一步为西黄丸抗脑胶质瘤的作用机制研究提供一个有价值的依据。动物福利和实验过程获得南京中医药大学实验动物伦理委员会标准(批准号:ACU221001)。

西黄丸下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态形成的作用及其机制

探究西黄丸含药血清调控低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)/血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)/血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)信号通路,抑制脑胶质瘤细胞血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)形成的作用及机制。采用对雄性SD大鼠连续灌胃给药7天,制备西黄丸含药血清(动物实验伦理审批号:202105A051)。采用200μmol·L^(-1)CoCl2构建U251细胞低氧模型,给予西黄丸含药血清后,CCK-8法、细胞克隆实验检测U251细胞活力和增殖情况;流式细胞术检测U251细胞凋亡及周期;细胞划痕愈合、Transwell侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力;3D细胞培养检测U251细胞VM的形成情况;Westernblot法检测U251细胞HIF-1α、VEGFA、VEGFR2、磷酸化VEGFR2(phosphorylated-VEGFR2,p-VEGFR2)、血管内皮钙黏着蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)、Eph受体酪氨酸激酶A2(Eph receptor tyrosine kinases A2,EphA2)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶14(matrix metalloproteinase 14,MMP14)和层黏连蛋白γ2(lamininγ2)等蛋白表达水平。结果显示,低氧状态下,10%西黄丸含药血清对U251细胞活力、增殖、凋亡和细胞周期影响较小。与低氧模型组相比,10%1.0、1.5和2.0 h组西黄丸含药血清均显著减慢U251细胞的迁移速率(P<0.01),显著减少侵袭的U251细胞数量(P<0.01)。10%2.0 h组西黄丸含药血清显著抑制低氧状态下U251细胞的VM管状结构形成(P<0.01)。Western blot实验显示,10%西黄丸含药血清显著下调HIF-1α、VEGFA、phospho-VEGFR2、VE-cadherin、EphA2、MMP14等蛋白表达(P<0.05)。综上所述,西黄丸可通过下调HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号通路,抑制脑胶质瘤U251细胞VM形成,发挥抗血管生成的作用。