二硫键和Ca2+结合残基对重组酱油曲霉碱性蛋白酶的影响

以PDB code:3f7o.1.A蛋白酶作为模板对酱油曲霉碱性蛋白酶(Alkaline protease,Ap)进行同源建模,对模拟的Ap结构分析可知,Ap中无二硫键,结合了1个Ca^2+.分别对预测的Ap二硫键和Ca^2+结合残基进行突变,获得增加二硫键的Y34C-R123C、L178C-T252C、Y34C-R123C/L178C-T252C和Ca^2+结合位点的T179G、D200G、T179G-D200G共6个突变.分别将这些突变基因电转至毕赤酵母KM71中,获得重组菌株;对重组菌株诱导表达,分离纯化突变型Ap,并对其稳定性进行分析.结果表明,Y34C-R123C突变型、L178C-T252C突变型与野生型Ap的表达量差异不显著;在40℃以下,Y34C-R123C突变型比野生型Ap具有更强的热稳定性;T179、D200被突变为甘氨酸后,不利于Ap正确折叠,不能成功表达.

全龄人工饲料育与桑叶育家蚕生丝的蛋白质成分比较

实现家蚕全龄人工饲料育是未来蚕业发展的主攻方向之一。尽管已经有商业化的家蚕人工饲料,但很多家蚕品种不适宜全龄人工饲料育。本课题组通过长期的人工饲料育选择,培养出了适宜人工饲料育的家蚕品种桂蚕5号,并已经在生产上推广。为了解桂蚕5号全龄人工饲料育蚕茧缫丝后生丝品质是否与桑叶育有差异,对全龄人工饲料育家蚕生丝(SL)和桑叶育家蚕生丝(SY)进行蛋白质成分的比较分析;同时,辅以6A级生丝作为高品质生丝对照。结果表明,3个样品检测到共有蛋白242种,SL含有特有蛋白15种,SY含有13种,6A级生丝含有13种,主要为一些低丰度蛋白。对共有蛋白进行含量差异分析,结果显示,SL与SY的差异蛋白总共只有20种,SL与6A级生丝的差异蛋白有14种。对LFQ强度值排名前20的蛋白质进行分析发现,主要是丝素蛋白、丝胶蛋白、类P25蛋白及未知功能蛋白,与已经报道的结果基本一致。而且,SL的丝素蛋白、丝胶蛋白含量与SY和6A级生丝相比都没有显著差异。利用丝蛋白抗体对3种生丝的丝胶和丝素蛋白进行Western blot验证,发现丝素蛋白Fib-L和P25以及丝胶蛋白Ser1和Ser3在3种生丝中的信号强度基本一致,但在SL中检测到了强烈的Ser2蛋白信号,由于Ser2为非茧丝蛋白,推测其对生丝的性能没有大的影响。综上所述,桂蚕5号进行全龄人工饲料育所缫制生丝的蛋白质成分含量与桑叶育生丝及6A级生丝没有显著差异,具有替代桑叶育所缫制生丝用于后期高品质茧丝制品开发和应用的潜能。