HPLC法测定蒙药甘露解毒丸中连翘酯苷A的含量研究

目的:建立高效液相色谱法测定蒙药甘露解毒丸中连翘酯苷A的含量。方法:色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.4%冰醋酸(15∶85,V/V)为流动相,流速为0.8 mL/min,检测波长330nm,柱温为30℃,进样量为10μL。结果:连翘酯苷A在0.1~1.4μg范围内呈现良好线性关系,线性方程为Y=2302379X+2377(r=0.9999,n=6);专属性良好;精密度和稳定性的RSD分别为0.40%和0.80%。平均加样回收率为94.34%,RSD为1.26%(n=9)。测定两批甘露解毒丸样品,平均含量为0.7772 mg/g,RSD为0.71%。结论:高效液相色谱法测定连翘酯苷A的含量操作简便,重现性好,灵敏度较高,适用于甘露解毒丸中连翘酯苷A的含量测定。

高效液相色谱法测定特格喜-18丸中羟基红花黄色素A的含量

目的建立使用高效液相色谱法测定蒙药特格喜-18丸中羟基红花黄色素A含量的方法。方法色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-乙腈-0.7%磷酸(20∶2∶78,V/V)(三乙胺调pH至6.0±0.1)为流动相,流速为0.8 ml/min,检测波长为403 nm,柱温30℃,进样量10μl。结果羟基红花黄色素A在3.27~65.40 mg/ml范围内呈现较好线性关系,线性方程为Y=23064454X+61414(r=0.9996,n=5);专属性良好;精密度和稳定性的RSD分别为0.94%和0.70%。平均加样回收率为93.68%,RSD为1.02%(n=9)。测定2批特格喜-18丸样品,平均含量为0.7770 mg/g,RSD为0.93%。结论高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A的含量操作简便,重现性好,灵敏度较高,适用于特格喜-18丸中羟基红花黄色素A的含量测定。

A型产气荚膜梭菌α毒素Thr-272基因定点突变与结构分析

利用定点突变技术,将A型产气荚膜梭菌α毒素(CPA)第272位苏氨酸(ACA)定点突变成脯氨酸(CCG),构建了含CPA突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-T272P)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pMCPA-T272P含有CPA-Thr272Pro突变基因,且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-T272P)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的18.34%。应用ExPASy服务器上的SOPMA法对CPA和CPA-Thr272Pro突变体分子进行二级结构预测,同时模拟了其3D结构。结果显示,CPA和CPA-Thr272Pro突变体蛋白的二级结构主要是由α-螺旋和无规则卷曲组成,3D结构非常相似。CPA和CPA-Thr272Pro突变体蛋白的圆二色(CD)光谱分析发现二者的CD光谱有一些微小变化。磷脂酶C活性检测结果表明,CPA-Thr272Pro突变体蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性。免疫试验结果表明,用CPA-Thr272Pro突变体蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。

A型产气荚膜梭菌α毒素His-68基因的定点突变与结构分析

利用定点突变技术,将A型产气荚膜梭菌α毒素(CPA)第68位组氨酸(CAT)定点突变成甘氨酸(GGT),构建了含CPA突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-H68G)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pMCPA-H68G含有CPA-His68Gly突变基因,且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pMCPA-H68G)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的31.65%。应用EXPASY服务器上的SOPMA法对CPA和CPA-His68Gly突变体分子进行二级结构的预测,同时模拟了其三级结构。结果显示,CPA和CPA-His68Gly突变体的二级结构主要是由α螺旋和无规则卷曲组成的,三级结构非常相似。