武夷菌素产生菌Fosmid文库的构建及文库探针的获得

以不吸水链霉菌武夷变种CK-15为材料，提取基因组DNA，经Sau3AI部分酶切后回收35—40kb之间的片段。连接到pCC1FOS载体上，经过包装转染涂布后构建得到了CK-15基因组的Fosmid文库，文库的滴度为8．8×10^5CFU／mL。随机挑取16个阳性克隆，经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切电泳分析，样品插入片段平均长度大于35kh，插入率为100％，符合构建文库的要求。根据多氧霉素、尼克霉素生物合成基因及大环内酯类聚酮合成酶基因（PKS）设计特异性引物，以基因组为模板进行PCR扩增，筛选特异性引物探针。结果用大环内酯类聚酮合成酶基因设计引物扩增出1693bp的片段经Blast比对其与大环内酯类抗生素生物合成基因相似性为95％以上。武夷菌素产生菌CK-15 Fosmid文库的构建及文库探针的获得，为武夷菌素生物合成基因的克隆奠定了基础。

抗生素生物合成基因簇的克隆策略

链霉菌能产生许多具有重要价值的次级代谢产物如农用抗生素、植物生长调节剂等。链霉菌的基因克隆和重组为发展次级代谢产物和开发新型抗生素提供了可能,抗生素生物合成基因簇的鉴定为其生物合成、调控、自身抗性机制的研究提供了巨大的信息。本文重点介绍了抗生素生物合成基因簇的克隆策略。

武夷菌素产生菌阻断突变株的筛选及分析

以不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis为出发菌株,分别用亚硝基胍、氯化锂、微波为单一诱变剂,亚硝基胍和氯化锂为复合诱变剂进行处理,从亚硝基胍处理的菌株中筛选到1株丧失抑菌活性且性状稳定的突变株N1。突变株孢子丝为长螺旋形,孢子呈椭圆形,与出发菌株相比,在形态上没有显著变化且产孢量无变化。突变株的抑菌活性发生了显著变化,对所有8种供试菌株均无抑制作用。HPLC结果显示与出发菌株不同,突变株中抗生素的特征峰消失。本研究为今后开展武夷菌素合成途径和生物合成基因研究奠定基础。

不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建

旨在对不吸水链霉菌武夷变种CK-15的遗传转化体系进行初步的探索及建立。首先对内源质粒的存在及对抗生素敏感性进行了测定,结果显示,在不吸水链霉菌武夷变种CK-15中不存在外源质粒。最终确定最适培养基为MS培养基,最适热激温度与时间为50℃热激10 min,37℃温育最适时间为2.5 h,最佳抗生素水溶液覆盖时间为16-18 h,并对转化子进行了验证。

拮抗细菌A2菌株的鉴定及其对小麦白粉病的防治效果

为适应现代无公害农业的发展,针对小麦白粉病的防治,从保护地土壤中分离得到一株生防细菌A2。通过形态学特征、生理生化特性的观察和测定,结合16S rDNA序列分析并构建系统发育树,对菌株A2进行了初步鉴定。同时,以清水为对照,测定了菌株A2对3432品种小麦白粉病的防治效果。结果显示该菌株主要特征是菌体杆状,内生芽孢、芽孢卵圆形,革兰氏染色阳性,好氧,接触酶反应、乙酰甲基甲醇实验为阳性,能利用柠檬酸盐;该菌株与亲缘关系较近菌株B.subtilis isolate G8的同源性达99%。结合以上两点,将菌株A2初步鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。防效实验显示菌株A2发酵液处理最好防治效果为72.22%;无菌滤液处理最好防治效果为29.24%,与对照相比均具有显著性差异(α=0.05)。表明,拮抗菌株A2菌体与代谢产物对小麦白粉病都具有较强的防治作用,为研制型、无毒、无公害生物农药提供了依据。

武夷菌素部分生物合成基因簇的克隆和分析

不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15是从福建省武夷山土样中分离得到的一株链霉菌,其代谢产物武夷菌素对果蔬真菌病害具有良好的防治效果,但是因其产量低的缺点限制了武夷菌素工业化生产和农业生产中的应用。为了实现利用基因工程培育高产新菌株的目标,首先要获得武夷菌素的生物合成基因。根据大环内酯类抗生素聚酮合成酶基因设计引物筛选菌株CK-15的基因组文库,共获得9个阳性克隆。克隆和测序获得3个较长scaffold片段,序列总长度达53.291 kb,其中包含了14个可能阅读框,通过同源比对证实该序列与S.noursei ATCC 11455的制霉素生物合成基因有很高的同源性。本研究为进一步研究武夷菌素生物合成基因的功能,并通过基因工程培育高产新菌株奠定了基础。

应用SAS软件优化武夷菌素产生菌发酵培养基

武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygros copicusvar.wuyiensis)产生的一种农用抗生素,对多种作物的真菌病害防治效果显著。为进一步提高武夷菌素产生菌的产量、降低其生产成本,应用SAS软件提供的Plackett-Burman设计法和响应面分析法对该菌株的发酵培养基进行优化组合,以期找到适宜武夷菌素产生菌C-75生产的最佳发酵培养基配方。应用Plackett-Burman设计法从9种培养基成分中筛选出玉米粉和碳酸钙为两个重要因素;通过响应面回归分析结果建立响应面回归模型:Y=5826.99-91.56X2-180.69X8-194.31X22-151.25X2X8-205.31X82。回归模型预测当玉米粉和碳酸钙的含量分别为2.314g和0.205g(50mL培养基装量)时,该模型能取到最大值。摇瓶发酵试验结果表明,该模型稳定点处的实际效价平均值为5837μg/mL,菌株C-75经优化培养基发酵后的效价较之前提高了5.59%。

柴胡疏肝散治疗非酒精性脂肪肝的临床研究

目的:观察柴胡疏肝散治疗非酒精性脂肪肝的临床效果。方法:选取2015年6月至2016年12月在河南省人民医院收治的70例非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者,随机分为两组。观察组40例采用经典方剂柴胡疏肝散治疗,对照组30例给予多烯磷酯酰胆碱胶囊治疗。观察两组疗效。结果:观察组治疗后血脂水平较本组治疗前均降低(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇(HDL–C)升高(P<0.05)。观察组治疗后肝功能较同组治疗前均降低(P<0.05),对照组治疗后谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)较同组治疗前均降低(P<0.05),结果显示为观察组疗效优于对照组。结论:经典方剂柴胡疏肝散具有明确的降脂保肝作用。