TLR2、TLR4及MyD88高表达与Cm呼吸道感染肺组织炎症相关

目的:探讨沙眼衣原体呼吸道感染过程中C3H/HeN(C3H)小鼠过度炎症反应的机制。方法:C3H与C57BL/6(C57)小鼠鼻腔吸入1×10~3IFU沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Cm),建立沙眼衣原体小鼠肺炎模型,使用RT-PCR检测感染后不同时间点小鼠肺组织Toll样受体TLR2、TLR4及转导蛋白MyD88 mRNA的表达。结果:使用1×10~3IFU的Cm呼吸道感染C3H与C57BL/6(C57)诱导小鼠衣原体肺炎,Cm感染在高易感性的C3H小鼠及低易感的C57小鼠均诱导Toll样受体的表达,但在感染后第7天及第14天,高易感的C3H小鼠肺组织中TLR2和TLR4 mRNA的表达均显著高于C57小鼠,尤其TLR2(P<0.001或P<0.05),进一步研究发现Cm呼吸道感染C3H小鼠肺组织My D88mRNA的表达也显著高于C57小鼠,并在感染后第14天仍维持高表达。结论:Cm呼吸道感染诱导TLR2、TLR4及MyD88在高易感的C3H小鼠肺组织高表达,可能与C3H小鼠肺组织过度炎症反应相关。

IL-21/IL-21R介导的CD4^(+)T细胞在沙眼衣原体小鼠肺炎菌株呼吸道感染中的作用

目的:探讨IL-21/IL-21R介导的CD4^(+)T细胞在沙眼衣原体呼吸道感染中的作用。方法:利用C57BL/6小鼠(WT小鼠)和IL-21R-/-小鼠,鼻腔吸入沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum;Cm)建立小鼠沙眼衣原体呼吸道感染模型。流式细胞术检测小鼠Cm呼吸道感染后0、3、7、14 d小鼠肺、脾组织中CD4^(+)T细胞数量、活化程度和功能,ELISA分析脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的含量。监测过继转移WT-CD4^(+)T细胞和IL-21R-/--CD4^(+)T细胞的na?ve WT小鼠Cm呼吸道感染后的体重变化,并分析感染后14 d的肺部细菌载量和病理情况,流式细胞术检测肺中性粒细胞(CD45+CD11b+Gr-1 high)、肺泡巨噬细胞(CD45+F4/80+CD11c high)、Th1(IFN-γ+CD4^(+))和Th2(IL-4^(+)CD4^(+))细胞的比例,ELISA分析脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的含量。结果:Cm呼吸道感染后,与WT小鼠相比,IL-21R-/-小鼠脾、肺组织CD4^(+)T细胞数量和活化程度以及Th1细胞比例均升高,Th2细胞比例下降,脾细胞培养上清中IFN-γ含量升高,IL-4含量下降。过继转移IL-21R-/--CD4^(+)T细胞的受体小鼠在Cm呼吸道感染后体重下降幅度减小,肺组织细菌载量和病理情况减轻,肺Th1细胞比例升高,脾细胞培养上清中IFN-γ含量增加。结论:IL-21/IL-21R介导的CD4^(+)T细胞通过抑制Th1细胞免疫应答加重Cm呼吸道感染。

树突状细胞在沙眼衣原体小鼠肺炎株呼吸道感染中免疫保护作用的研究

目的探讨树突状细胞(dendritic cells,DC)在沙眼衣原体小鼠肺炎株(Chlamydia muridarum,Cm)呼吸道感染中的作用以及对适应性免疫应答的影响。方法C57BL/6小鼠经鼻腔吸入1×10^(3)包涵体形成单位(inclusion-forming units,IFU)Cm建立小鼠呼吸道感染模型。流式细胞术检测感染后0、3、7 d脾组织中总CD11c^(+)MHCⅡ^(+)DC比例和共刺激分子(CD40、CD80和CD86)表达情况;qPCR检测小鼠脾组织中DC细胞因子IL-12p40、IL-10和IL-6 mRNA的表达;磁珠分选出Cm感染后7 d的小鼠脾组织DC并过继转移给受体小鼠,于感染后14 d利用细胞内细胞因子染色检测受体小鼠Th1应答水平。结果Cm感染诱导小鼠脾组织DC大量浸润并且共刺激分子表达增加;脾组织DC细胞因子IL-12和IL-10 mRNA的表达在感染后3 d达到高峰;将Cm感染小鼠脾组织DC过继转移给受体小鼠,受体小鼠感染Cm后疾病减轻,肺组织衣原体繁殖降低,且肺和脾组织中的Th1细胞比例显著升高。结论DC在Cm感染后成熟、活化并促进Th1细胞免疫应答,在衣原体呼吸道感染中发挥免疫保护作用。

γδT细胞在小鼠沙眼衣原体感染中通过促进Th17免疫应答发挥免疫保护作用

目的探讨γδTT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染中的作用以及对衣原体特异性适应性免疫应答的影响。方法WT（C57BL／6）小鼠和TCRδ^-/-小鼠（C57BL／6背景）经鼻腔吸入1×10^3IFU的沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Chlamydia muridarum，Cm），建立沙眼衣原体小鼠呼吸道感染模型。酶免疫法检测感染不同时间的小鼠肺组织衣原体生长情况，用衣原体包涵体形成单位（IFU）代表衣原体繁殖；ELISA法测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-17的产生；细胞内细胞因子染色检测小鼠肺组织CD3^＋CD4^＋T细胞IFN-γ（Th1免疫应答）及CD3^＋CD4^＋T细胞IL-17（Th17免疫应答）的水平，确定γδT细胞对宿主特异性抵抗衣原体的Th1、Th17免疫应答的调节作用。结果经鼻腔吸入一定剂量Cm诱导小鼠沙眼衣原体肺炎，与WT小鼠比较，TCRδ^-/-小鼠感染Cm早期体重下降更明显，但是两组小鼠肺组织衣原体繁殖水平未见显著差异。ELISA结果显示，WT与TCRδ^-/-小鼠在Cm呼吸道感染后的第3天和第7天IFN-γ分泌无显著差异，感染第7天TCRδ^-/-小鼠IL-17分泌显著低于WT小鼠；细胞内细胞因子染色结果提示感染第3天和第7天TCRδ^-/-小鼠CD3^＋CD4^＋T细胞分泌IL-17的量显著低于WT小鼠，IFN-γ未见显著差异。结论γδT细胞通过促进抗衣原体特异性的Th17应答发挥免疫保护作用。

沙眼衣原体呼吸道感染诱导PI3K/AKT/Bcl-2/Bax通路活化促进CD4^＋ T细胞凋亡

目的探讨PI3K/AKT/Bcl-2/Bax途径在小鼠沙眼衣原体呼吸道感染中的诱导活化及CD4^＋T细胞的凋亡。方法C57BL/6小鼠，经鼻腔吸入1×10^3 IFU沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Cm），诱导小鼠衣原体肺炎。于感染的不同时间点分离小鼠肺组织单个核细胞，RT-PCR检测PI3K p110δ mRNA表达；Western blot检测p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白表达；流式细胞术检测不同感染时间小鼠肺组织CD4^＋ T细胞的凋亡。结果与未感染组比较，小鼠Cm呼吸道感染诱导感染肺组织PI3K p110δ mRNA表达及PI3K下游分子p-AKT蛋白表达增高，两者均于感染第3天显著增高，第7天达到高峰，感染第14天有所降低。同时，Cm呼吸道感染也诱导凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax蛋白表达显著增高，均于第7天达到高峰，但Bcl-2/Bax比值依感染时间降低，提示抗凋亡作用逐渐降低，细胞凋亡增加。Cm感染诱导小鼠肺组织CD4^＋T细胞的凋亡，于感染第3天早期凋亡（Annexin＋PI＋）和细胞总凋亡（Annexin＋PI）均开始增高（P〈0.05），感染第7天达高峰（P〈0.001）。结论Cm小鼠呼吸道感染诱导PI3K/AKT/Bcl-2/Bax通路活化导致CD4^＋ T细胞凋亡。

沙眼衣原体呼吸道感染诱导γδT细胞在肺组织增殖并产生大量IFN-γ及IL-17

目的探讨小鼠沙眼衣原体呼吸道感染不同时期γδT细胞的增殖、活化及细胞因子的产生。方法C57BL／6小鼠鼻腔吸入3×10^3IFU（inclusion-forming units）沙眼衣原体小鼠肺炎株（Chlamydia muridarum，Cm）建立小鼠沙眼衣原体肺炎模型。取感染后不同时间点小鼠肺组织进行单个核细胞分离，利用流式细胞术检测小鼠肺CD3^＋TCRγδT细胞百分率，并检测γδT细胞表面分子CD69的表达水平；利用细胞内细胞因子染色技术检测γδT细胞IFN-γ和IL-17的产生。结果一定剂量的Cm经呼吸道感染诱导小鼠衣原体肺炎。与未感染的对照组比较，Cm感染诱导小鼠肺组织γδT细胞百分率及γδT细胞总数逐渐升高，于感染后第7天达到高峰，随后逐渐下降；肺组织γδT细胞表面活化分子CD69表达于感染后第3天达高峰，此后略有降低。Cm感染诱导γδT细胞分泌大量IFN-γ、IL-7，于感染后第3天达到高峰；相比αβT细胞，γδT胞主要在感染早期（感染后前3天）分泌大量IFN-γ和IL-17，而后期CD3^＋CD4^＋T细胞产生IFN-γ和IL-17的能力逐渐高于γδT细胞。结论一定剂量的Cm呼吸道感染可以诱导小鼠γδT细胞在感染局部大量聚集及活化，γδT细胞是宿主抗衣原体免疫应答早期分泌IFN-γ和IL-17的主要细胞类型。

产生IL-17的γδT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染早期促进中性粒细胞的募集

目的探讨沙眼衣原体呼吸道感染早期产生IL-17的γδT细胞对中性粒细胞募集的影响及其机制。方法WT（C57BL/6）与TCRδ－/－小鼠鼻腔吸入3×103 IFU（inclusion-forming units）沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Chlamydia muridarum, Cm），建立沙眼衣原体小鼠肺炎模型。分离感染不同时间点小鼠肺组织单个核细胞，流式细胞术检测肺组织CD11b＋Gr1＋中性粒细胞（PMN）百分率；细胞内因子染色检测γδT细胞IL-17的合成；RT-PCR检测小鼠肺组织IL-17及KC（中性粒细胞趋化因子）、IL-6 mRNA表达。结果一定剂量的Cm呼吸道感染诱导小鼠肺组织γδT细胞分泌大量IL-17，与未感染组比较，感染后第3天小鼠肺组织CD3＋ γδT＋细胞分泌的IL-17显著增加（P〈0.001），并且持续到感染的第7天（P〈0.05）；TCRδ－/－小鼠Cm呼吸道感染后第3天肺组织IL-17 mRNA的表达以及PMN百分率显著低于WT鼠；进一步研究显示TCRδ－/－小鼠在感染后第3天及第7天中性粒细胞趋化因子KC和IL-6在小鼠肺组织的表达显著降低。结论产生大量IL-17的γδT细胞可能通过上调KC和IL-6的表达在沙眼衣原体呼吸道感染中发挥PMN募集作用。

沙眼衣原体小鼠肺炎菌株呼吸道感染诱导肺泡巨噬细胞和肺间质巨噬细胞浸润并极化

目的探讨沙眼衣原体呼吸道感染对肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AMs)和肺间质巨噬细胞(interstitial macrophages,IMs)浸润并向M1型或M2型极化的影响。方法C57BL/6小鼠以鼻腔吸入沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm)建立小鼠沙眼衣原体呼吸道感染模型。采用流式细胞术检测Cm呼吸道感染后0 d、3 d、7 d、14 d肺组织中AMs(CD45^(+)F4/80^(+)CD11c^(+))和IMs(CD45^(+)F4/80^(+)CD11c-)比例并分析细胞数目,同时检测AMs和IMs中M1型巨噬细胞(CD80^(+)、CD86^(+)、MHCⅡ^(+)、iNOS^(+)细胞)比例和M2型巨噬细胞(CD206^(+)、Arg1^(+)细胞)比例。结果(1)Cm呼吸道感染诱导AMs和IMs浸润,与未感染组(0 d)比较,感染后3 d AMs和IMs比例和数目显著增加(P<0.05和P<0.01),感染后7 d AMs和IMs数目均达峰值(P<0.001)。(2)与未感染组比较,感染后3 d AMs中CD80^(+)和CD86^(+)细胞比例明显升高(P<0.05和P<0.01);AMs中MHCⅡ^(+)细胞比例在感染后持续升高,于14 d达峰值(P<0.05),CD206^(+)细胞比例在感染后持续降低(P<0.05)。(3)与未感染组比较,感染后3 d IMs中CD80^(+)和CD86^(+)细胞比例显著升高(P<0.05和P<0.001),感染后14 d MHCⅡ^(+)细胞比例明显升高(P<0.01),CD206^(+)细胞比例变化差异无统计学意义。(4)AMs中iNOS^(+)细胞比例在感染后持续升高(P<0.01);AMs中Arg1^(+)细胞比例在感染后持续降低,与未感染组比较,感染后7 d和14 d显著降低(P<0.05)。IMs中iNOS^(+)细胞比例于感染后7 d达峰值(P<0.001),IMs中Arg1^(+)细胞比例变化差异无统计学意义。结论Cm呼吸道感染诱导AMs和IMs浸润并刺激AMs和IMs向M1型巨噬细胞极化,减弱AMs中M2型巨噬细胞极化水平,而对IMs中M2型巨噬细胞极化无显著影响。