气相色谱法测定水果蔬菜中克菌丹残留

目的:研究水果中克菌丹残留量的分析方法,讨论色谱分离和测定的条件及样品前处理条件。方法:样品以乙酸乙酯振荡提取,采用硅胶/活性炭固相萃取净化,正己烷与丙酮的混合液为洗脱液,选用HP-5毛细管色谱柱,以具电子捕获检测器(ECD)的气相色谱(GC)仪测定水果中克菌丹残留量。结果:本法的检出限为0.5μg/m l,最低检出浓度为0.07 mg/kg,线性方程Y=1.4083X-1.0092(r=0.9986),平均加标回收率为104.3%。结论:该方法具有操作简便,净化效果好,灵敏度高等特点,完全可满足水果中克菌丹残留检测的要求。

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的真核表达及多克隆抗体的制备

为表达非洲猪瘟病毒B602L重组蛋白,制备相应的多克隆抗体,根据NCBI网站上公布的非洲猪瘟病毒(Pig/HLJ/2018株)B602L基因序列进行密码子优化和基因合成,随后克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组杆状病毒质粒,再把重组杆粒转染昆虫细胞Sf9,拯救重组B602L基因的杆状病毒。经间接免疫荧光和western blots鉴定结果显示,B602L重组蛋白与His标签抗体、非洲猪瘟标准阳性血清均能发生特异性反应,并且B602L重组蛋白可以细胞分泌上清的形式进行表达。通过His镍株亲和纯化的方式纯化重组蛋白,B602L蛋白大小约70 ku,与预期相符。将B602L重组蛋白与弗氏佐剂配比免疫BALB/c小鼠,制备小鼠多克隆抗体,经间接ELISA检测,该抗体效价可达1∶512000,并且与B602L重组蛋白具有良好的反应性。本研究可为进一步研究非洲猪瘟B602L蛋白的结构与功能、研制非洲猪瘟诊断制品提供生物材料。

草鱼出血病疫苗的发展历程及市场现状剖析

就草鱼在我国淡水养殖品种中所处的重要地位,引申出危害草鱼的主要疾病-病毒性出血病为背景,概述防控出血病的有效方法、疫苗的发展历程及其在市场上的使用现状,并就当前疫苗在使用过程中出现的问题和注意事项进行剖析,以期为广大养殖户更好的掌握草鱼出血病疫苗相关知识及规范使用提供借鉴。

H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。

H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

为构建H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒,研制新型基因工程疫苗。利用杆状病毒一昆虫细胞表达系统,在Sf9细胞中共表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白和M1蛋白。将H5亚型禽流感病毒的HA基因和M1基因分别克隆至pFastBac-dual载体PH和P10启动子下游多克隆位点,获得穿梭质粒pFastBac-H5-M1,再通过蓝白斑筛选获得重组杆粒,将重组杆粒转染至昆虫细胞Sf9中,拯救重组杆状病毒,通过间接免疫荧光、westernblot试验鉴定是否表达特异性蛋白,最后在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。重组H5亚型禽流感病毒HA基因和M1基因的杆状病毒,在Sf9细胞中盲传3代后,可在显微镜下观察到杆状病毒感染引起的细胞肿胀破裂等细胞病变;通过间接免疫荧光试验可观察到细胞内绿色荧光信号,证明重组杆状病毒拯救成功;westernblots试验结果显示Sf9细胞中可检测到HA蛋白和M1蛋白,目的条带大小分别为70ku和25ku左右,与预期相符,并且均以分泌上清的形式表达;通过透射电镜可在Sf9细胞上清中观察到与流感病毒结构类似的颗粒。本研究成功构建共表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白和M1蛋白的重组杆状病毒,该重组杆状病毒可在Sf9昆虫细胞中组装成与天然流感病毒粒子结构相似的颗粒样物质。