Let-7a表达质粒的构建及其对肺癌A549细胞k-Ras蛋白表达的抑制作用

目的探讨let-7a介导的基因表达调控在肺癌形成中的作用。方法依据miRBase数据库中hsa-let-7a序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建重组质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control。将pGenesil-let-7a及pGenesil-control转染肺癌A549细胞,经G418筛选,建立稳定表达let-7a-GFP及control-GFP的细胞株。采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线;半定量RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学检测k-Ras表达的差异。结果经测序证实重组质粒构建成功,与未处理的A549细胞和稳定表达pGenesil-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-let-7a的A549细胞中,细胞生长明显减慢,k-Ras的蛋白表达明显降低,而k-Ras的mRNA水平无明显变化。结论 let-7a在翻译水平抑制了k-Ras的表达,并对细胞生长具有显著的抑制作用。

脐带间充质干细胞源性多巴胺能神经元中脑源性神经生长因子的表达研究

目的将人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)诱导分化为多巴胺能神经元并观察其中脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。方法将P3代脐带MSCs接种24孔细胞培养板,培养24 h后更换神经诱导液,诱导9 d后加入BDNF。终止诱导后应用免疫荧光染色检测细胞中酪氨酸羟化酶(TH)、β-微管蛋白Ⅲ、神经元核抗原(NeuN)和BDNF的表达。结果 HUCMSCs经特定细胞因子诱导后可分化形成成熟的神经元,分化比例约为70%;其中定向分化形成TH阳性细胞的比例为(17.65±1.91)%;BDNF表达比例为(14.15±3.04)%。结论 HUCMSCs经诱导后可向多巴胺能神经元分化,且分化后的细胞可表达BDNF。

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。目的:以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。方法:采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。结果与结论:诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平较未诱导组显著增加(P<0.05)。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。

体外培养和诱导人脐带源间充质干细胞定向分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨体外培养并应用5-氮胞苷(5-aza)诱导人脐带源间充质干细胞(hUC MSCs)是否能分化为心肌细胞。方法足月顺产或剖宫产患者的脐带在无菌条件下剪碎后采用贴壁培养法分离、纯化hUC MSCs,采用5-aza对P3代hUC MSCs进行诱导24 h后继续培养4周,采用倒置显微镜观察细胞形态学的变化,同时采用免疫组织化学方法测定肌钙蛋白I(cTnI)的表达。结果采用贴壁培养法可从脐带组织获得大量hUC MSCs。5-aza诱导4周后免疫组织化学鉴定cTnI表达阳性。结论人脐带贴壁培养可获得大量的hUC MSCs,hUC MSCs体外经5-aza诱导可定向分化为心肌细胞。

RI基因siRNA干扰质粒的构建及其对人膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的构建核糖核酸酶抑制因子(RI)基因siRNA干扰质粒,并检测其对人膀胱癌细胞BIU-87迁移和侵袭能力的影响。方法设计并构建针对RI基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体和1个无同源性的阴性对照载体,经酶切和DNA测序鉴定后,转染BIU-87细胞,通过RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测干扰的有效性。光镜及HE染色观察细胞形态的改变,黏附试验、划痕试验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构。结果酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性siRNA表达载体的BIU-87细胞RI蛋白的表达水平明显降低,对照组未发生明显改变;转染干扰质粒的细胞堆叠严重,细胞黏附能力显著降低,迁移和侵袭能力显著提高,细胞骨架微丝聚集,伸展出片状伪足。结论已成功构建RI基因siRNA干扰质粒,其可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,说明RI可作为抑制肿瘤迁移和侵袭的有效靶点。

重组人核糖核酸酶抑制因子腺相关病毒的构建及表达

目的构建携带全长人核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease inhibitor,RI)基因的重组腺相关病毒,并在膀胱癌细胞T24中表达。方法 Trizol法提取人脐静脉内皮细胞ECV30总RNA,经RT-PCR扩增RI基因,克隆至pUCm-T质粒中,再亚克隆至pAAV-IRES-hrGFP载体,构建pAAV-IRES-hrGFP-RI重组质粒,与pAAV-RC和pAAV-Helper质粒共转染HEK293细胞,包装并扩增腺相关病毒RI-AAV,检测其感染性滴度,并转染T24细胞,采用RT-PCR检测RI基因mRNA的转录水平,Westernblot检测RI蛋白的表达水平。结果重组质粒pAAV-IRES-hrGFP-RI经酶切及测序鉴定构建正确;重组腺相关病毒RI-AAV的感染性滴度为1.1×1010U/ml;RI-AAV转染的T24细胞RI基因mRNA的转录水平及蛋白表达水平较未转染组及空病毒转染组均显著提高,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论已成功构建人RI基因重组腺相关病毒,为进一步研究RI对膀胱癌细胞的侵袭和转移的作用奠定了基础。

人脐带间充质干细胞源性多巴胺能样神经元对帕金森病模型大鼠的疗效

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)源性多巴胺能样神经元对帕金森病(PD)模型大鼠的疗效。方法两步法将第3代hUC-MSCs诱导分化为多巴胺能样神经元。大鼠右侧纹状体注射6-羟基多巴制备PD模型。将24只PD模型大鼠随机均分为A、B、C和D四组,分别予假手术、注射不含细胞的培养基、hUC-MSCs和hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元。药物注入右侧纹状体和黑质。移植术后的第2周和第4周,腹腔注射阿扑吗啡观察大鼠旋转行为;移植后的第4周和第6周,采用Western blot及免疫组化方法检测大鼠脑内脑源性神经营养因子(BDNF)表达。结果 C、D组大鼠旋转行为较A组改善(P<0.01),且D组疗效优于C组(P<0.05)。D组大鼠纹状体和黑质区BDNF表达较A组增多(P<0.01);C、D组大鼠纹状体区BDNF表达阳性区域均较A组增加(P<0.01);D组大鼠纹状体BDNF表达多于C组(P<0.05)。结论hUC-MSCs及hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元均可改善PD大鼠的行为学症状,且hUC-MSCs源性多巴胺能样神经元的疗效更佳,其机制可能与BDNF表达上调有关。

结缔组织生长因子诱导胎盘间充质干细胞分化为皮肤成纤维细胞

目的探究胎盘间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向皮肤成纤维细胞分化的潜能，以及其用于皮肤创伤修复及作为种子细胞的可能性。方法酶消化法分离得到胎盘MSCs，体外培养扩增，用流式细胞术和成骨、成脂诱导进行MSCs鉴定。加入含50斗g／ml维生素c和100ng／ml结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）的DMEM／F12诱导胎盘MSCs16d，拍照记录形态变化，免疫荧光方法检测诱导前、后细胞内波形蛋白、人纤维母细胞表面抗原（ human fibroblast surface protein, FSP）、I型和Ⅲ型胶原、结蛋白及层粘连蛋白的表达变化，同时检测诱导后成骨、成脂分化能力变化。冻存复苏诱导后细胞，台盼蓝法检测细胞活率。结果胎盘MSCs经CTGF诱导之后，具有明显的成纤维细胞形态，波形蛋白、FSP-1、I型和Ⅲ型胶原及层粘连蛋白表达升高，且表达皮肤成纤维细胞特异性蛋白结蛋白，成骨、成脂分化能力减弱，胎盘MSCs成功诱导为皮肤成纤维细胞。诱导细胞冻存复苏后细胞活率大于90％。结论胎盘MSCs在体外可经CTGF诱导为皮肤成纤维细胞，胎盘MSCs有潜在的用于皮肤创伤修复价值，并可作为皮肤成纤维细胞的种子细胞保存。

为有源头活水来——浅谈新课程作文教学目标的落实

作文教学是语文教学中的一个老大难问题。在写作教学实践中，如何指导学生写作文，一直是困扰我们的教学难题，怎样把作文课讲得直观、生动，能引起学生的兴趣，是我经常思考的问题，因为每次布置写作文的时候，经常都会遇到学生问作文“要写什么”和“要怎样写”等问题，其实这两个问题，正反映出学生畏惧作文的主要原因。