人参皂苷Rg1对高糖环境下人脐带血间充质干细胞分泌炎症因子水平的影响

目的观察人参皂苷Rg1对高糖环境下人脐带血间充质干细胞(hUCBMSCs)分泌炎症因子的影响。方法无菌条件下取正常剖宫产胎盘中的脐带血,采用密度梯度离心法分离人脐带血间充质干细胞(hUCBMSCs)并鉴定。将鉴定成功的hUCBMSCs随机分为正常组、模型组、干预组。模型组和干预组加入含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基建立高糖受损细胞模型,正常组加入DMEM/F12培养基;培养5 d后,干预组加入40 mg/L的人参皂苷Rg1,正常组和模型组加入等量PBS,继续培养48 h。收集三组细胞上清液,采用酶联免疫吸附法检测炎症因子白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)水平。结果与正常组相比,模型组细胞上清液中IL-1、IL-6、MCP-1升高(P均<0.05);与模型组相比,干预组细胞上清液中IL-1、IL-6降低,IL-10、M-CSF升高(P均<0.05)。结论高糖环境下,人参皂苷Rg1可抑制hUCBMSCs中的促炎因子释放,促进抑炎因子分泌,从而发挥抑制炎症反应的作用。

黄芪甲苷干预的EPC-Exos对高糖诱导损伤间充质干细胞向内皮分化的影响

目的探讨黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)干预的人内皮祖细胞外泌体(Endothelial progenitor cells derived exosomes,EPC-Exos)对高糖诱导损伤人脐血间充质干细胞(Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)向内皮分化的影响。方法体外分离和培养人内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs),同时体外分离和培养hUCBMSCs,取P4代细胞分别进行成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定。将鉴定成功的EPCs分别用100mg·L-1的黄芪甲苷和等量的PBS干预,培养24 h后收集两组细胞上清液中外泌体。采用透射电子显微镜观察EPC-Exos的形态,利用纳米粒子追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)技术检测EPC-Exos的粒径,Western blot技术进行外泌体特征性标志物CD9、CD63和TSG101的检测。将hUCBMSCs用30 mmol·L-1的葡萄糖预处理120h后,随机分为实验组和对照组,同时设置正常组。三组细胞培养24 h后,通过Matrigel体外成管实验研究EPC-Exos对hUCBMSCs成管分化的影响。免疫荧光检测hUCBMSCs表达CD31、vWF等内皮细胞特异标志物的情况。结果光镜下hUCBMSCs边缘清楚,形态均一,排列呈漩涡状,3系细胞分化为典型图像。透射电镜观察分离及提纯后黄芪甲苷干预EPC-Exos为包膜完整的圆形或椭圆形微囊泡结构;NTA技术检测97.6%人EPC-Exos为直径在81.4-142.1nm之间的微囊泡;EPC-Exos表面特异标志物CD9、CD63、TSG101呈阳性,以上实验证实成功提取EPC-Exos。Matrigel成管实验显示,与对照组相比,实验组MSCs细胞体外成管能力显著增强,差异显著(P<0.001)。免疫荧光检测显示,与对照组相比,实验组MSCs表达内皮细胞特异性标志物CD31、vWF能力显著增强,差异显著(P均<0.01)。结论黄芪甲苷干预的EPC-Exos可有效恢复高糖受损人间充质干细胞的成管功能且显著改善其向内皮分化能力。

人参皂苷Rg1对高糖诱导损伤人脐血间充质干细胞生物学特性及分泌干细胞因子功能的影响

目的观察研究人参皂苷Rg1(GS-Rg1)对高糖诱导损伤人脐血间充质干细胞(hUCBMSCs)生物学特性及分泌干细胞因子(SCF)的影响。方法通过体外分离和培养hUCBMSCs,并取第4代细胞进行成骨、成软骨、成脂诱导分化鉴定。将鉴定成功的hUCBMSCs用含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养120 h,分别用不同浓度GS-Rg1(0、5、10、20、40、80 mg/L)处理,确定GS-Rg1促进高糖诱导损伤hUCBMSCs增殖的最佳浓度。将高糖诱导损伤hUCBMSCs分成试验组和对照组,另将用含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养的hUCBMSCs作为正常组。试验组用最佳浓度GS-Rg1干预,对照组和正常组用等容积磷酸盐缓冲液(PBS)干预,分别观察各组对高糖诱导损伤hUCBMSCs的增殖能力、黏附能力、迁移能力、抗凋亡能力及分泌SCF功能的影响。结果GS-Rg1促进高糖诱导损伤hUCBMSCs增殖的最佳浓度为40 mg/L。与正常组比较,对照组hUCBMSCs的增殖密度(OD)值、黏附数、迁移宽度及SCF含量均明显下降(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与对照组比较,试验组hUCBMSCs增殖OD值、黏附数、迁移宽度及SCF含量均明显增加(P<0.05),细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。结论GS-Rg1对高糖诱导损伤hUCBMSCs的生物学特性具有保护作用,能够明显促进hUCBMSCs增殖,提高黏附和迁移能力,减少细胞凋亡,并能促进SCF分泌。

黄芪甲苷介导内皮祖细胞外泌体改善高糖受损人内皮细胞生物学功能的研究

目的探讨黄芪甲苷(AS-Ⅳ)介导人内皮祖细胞外泌体(EPC-Exos)对高糖受损人内皮细胞生物学功能的影响。方法体外分离和培养人脐带血内皮祖细胞(EPCs);将鉴定成功的EPCs用100 mg/L的AS-Ⅳ液处理,培养24 h后,采用超速离心法结合超滤法提取EPCs分泌的外泌体即EPC-Exos,采用特异性标志物CD9、CD63、CD81鉴定EPC-Exos,透射电镜观察EPC-Exos的形态特征。同时体外分离、培养并鉴定人内皮细胞,将鉴定成功的内皮细胞用30 mmol/L的葡萄糖预处理120 h后,随机分为实验组(用EPC-Exos干预)和对照组(用PBS干预),同时设置正常组(无糖培养基培养的内皮细胞)。三组细胞培养24 h后,通过CCK-8细胞增殖检测试剂盒、细胞划痕试验、黏附能力测定试验及Matrigel体外成血管试验观察经AS-Ⅳ干预的EPC-Exos对高糖受损内皮细胞增殖、黏附、迁移和成管功能的影响。结果与正常组比较,对照组人内皮细胞增殖、迁移、黏附及成管能力显著降低(t=24.35、6.80、10.65、9.62,P<0.05)。与对照组比较,实验组人内皮细胞增殖、黏附、迁移及成管能力显著增强(t=30.68、5.99、5.40、8.25,P<0.05)。结论高糖受损状态下的人内皮细胞生物学功能严重受损;通过黄芪甲苷介导的EPC-Exos可显著改善高糖受损人内皮细胞的生物学功能,具有调节糖尿病损伤内皮血管新生的潜能。

黄芪甲苷介导间充质干细胞外泌体对高糖诱导损伤的内皮细胞生物学功能和细胞焦亡的影响

目的探讨黄芪甲苷(AS-IV)介导的间充质干细胞外泌体(MSC-Exos)对高糖诱导损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的生物学功能和细胞焦亡的影响。方法将人脐血间充质干细胞(hUCBMSCs)用400 mg/L的AS-IV干预后提取外泌体,行外泌体形态和特异性标志物鉴定。将HUVECs用30 mmol/L的葡萄糖干预制备成高糖诱导HUVECs损伤模型。将高糖受损HUVECs随机分为实验组和模型组,分别用100μg/ml的MSC-Exos和等体积的PBS液干预;同时设置空白对照组。采用CCK-8细胞增殖试验、黏附能力测定试验、Matrigel体外成管试验、划痕试验检测AS-IV介导的MSC-Exos对HUVECs增殖、黏附、成管、迁移能力的影响;采用Western blot、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组中焦亡相关分子Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白及其mRNA表达情况。结果高糖导致HUVECs细胞增殖、黏附数、成管数、迁移宽度较空白组下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);而Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白及其mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均P<0.001)。而用AS-IV介导的MSC-Exos干预下,HUVECs的细胞增殖、黏附数、成管数、迁移宽度较模型组明显上升,差异均有统计学意义(均P<0.05);Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白及其mRNA表达降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论AS-IV介导的MSC-Exos可明显改善高糖诱导损伤内皮细胞的生物学功能,其作用机制可能与抗细胞焦亡有关。

阿魏酸调控内皮祖细胞分泌外泌体及对表达血管新生微小RNA的影响

目的研究阿魏酸调控内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)分泌外泌体(exosomes,Exo)及对表达血管新生微小RNA的影响。方法将EPC随机分为实验组和对照组。实验组加入8 mg·L(-1)阿魏酸干预24 h,对照组用等容量的磷酸盐缓冲溶液干预24 h。用透射电子显微镜观察EPC-Exo形态,用蛋白质印迹法鉴定其特征性表面标志物,用二辛丁酸蛋白定量法检测总蛋白浓度,用实时荧光聚合酶链反应法检测EPC-Exo中血管新生相关miRNA分子的表达水平。结果培养24 h后,各组EPC-Exo呈圆形或椭圆形的膜囊泡结构,EPC-Exo特征性表面标志物CD9、CD63和TSG101的表达均呈阳性。干预24 h后,实验组与对照组的EPC-Exo蛋白浓度分别为(1.01±0.02)和(0.85±0.01)μg·μL(-1),miR-21表达水平分别为2.51±0.34和0.99±0.12,miR-126-5p表达水平分别为3.97±0.45和1.04±0.03,miR-146a-5p表达水平分别为8.04±0.52和1.06±0.05,miR-210表达水平分别为4.77±0.37和1.12±0.03,miR-214-5p表达水平分别为0.74±0.06和0.39±0.02,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论阿魏酸能促进EPC分泌Exo,且EPC-Exo中富含有与血管新生相关的miRNAs。