大鼠海马神经干细胞体外增殖、凋亡和分化的激光扫描共焦显微镜观察

目的采用激光扫描共焦显微镜观察体外培养胎鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖、凋亡及其分化情况。方法体外分离培养胚胎大鼠海马NSCs,把神经干细胞球培养在共焦显微镜专用培养皿中。用Hoechst33258染细胞核,免疫荧光细胞化学技术检测巢蛋白(Nestin)的表达以鉴定NSCs,检测神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲtubulin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达以测定NSCs的分化能力。通过激光扫描共焦显微镜对神经干细胞球进行光学连续断层扫描,然后用软件进行三维重建,立体动态观察神经球。结果通过激光扫描共焦显微镜观察到神经球Nestin阳性表达,NSCs的突起随着发育逐渐增长,并相互缠绕,经2次传代后培养7d的NSCs凋亡率为(8.60±2.20)%。在血清诱导下分化后的细胞突起从细胞球向四周呈放射状迁移,且突起相互交错成网状。经2次传代后诱导分化7 d的NSCs分化为星形胶质细胞和神经元的比例分别为(68.60±7.64)%和(29.90±8.22)%(P<0.01)。结论对大鼠神经干细胞球的增殖、凋亡及分化的观察激光扫描共焦显微镜发挥了独特的优势。

大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

构建脑源性神经营养因子（BDNF）基因真核表达载体，检测其转染COS-7细胞后的表达。方法：从大鼠海马组织中提取总RNA，采用RT-PCR方法获得目的基因片段，克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接。将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中，用RT-PCR鉴定BDNFmRNA的表达，免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平。结果：克隆了BDNF的cDNA，并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF，经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性；免疫印迹法分析显示，转染48h时，COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主，在96h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主。结论：成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体，并且在COS-7细胞中得到高效表达，BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外，在不同时间点分泌组合不同。

腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒(adenovirus)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在神经干细胞(NSCS)的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒(Ad/EGFP)转染NSCS,在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况,同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16 h后NSCS发出绿色荧光,在第7天左右荧光强度达高峰并可持续稳定表达20天左右,Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光,部分细胞β-Ⅲtubu lin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异(P>0.05)。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS,且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。

脑源性神经营养因子过表达促进大鼠神经干细胞向神经元分化

目的构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,探讨BDNF过表达对神经干细胞(NSCs)向神经元分化的影响。方法采用RT-PCR法,以大鼠海马组织RNA为模板,扩增BDNF基因,定向克隆到pEGFP-N1载体中,用脂质体法转染pEGFP-N1-BDNF表达载体至NSCs中,然后用RT-PCR鉴定BDNF的表达,免疫组织化学方法鉴定NSCs向神经元的分化情况。结果成功构建了pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,BDNF在重组质粒转染的NSCs中能够高效表达。重组质粒转染的NSCs在体外诱导分化后,能够较空质粒转染的NSCs产生更多的神经元(P<0.01)。结论 BDNF过表达能够显著促进大鼠NSCs向神经元方向分化。

大鼠少突胶质细胞转录因子2基因真核表达载体的构建

背景:碱性螺旋-环-螺旋转录因子少突胶质细胞转录因子2在脊髓的少突胶质细胞的分化过程中起着关键性的作用。目的:构建大鼠少突胶质细胞转录因子2基因重组真核表达载体,观察其在真核细胞内的表达。方法:从新生大鼠脊髓组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后将少突胶质细胞转录因子2cDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接。将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-Olig2以脂质体法转染至COS-7细胞中,反转录PCR鉴定少突胶质细胞转录因子2mRNA的表达,免疫印迹法检测少突胶质细胞转录因子2蛋白质表达水平。结果与结论:克隆了少突胶质细胞转录因子2的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-Olig2,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;转染72h时免疫印迹分析显示,COS-7/pEGFP-N1-Olig2实验组COS-7细胞表达Olig2-GFP融合蛋白。提示实验成功构建pEGFP-N1-Olig2真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达。

NT-3基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及向神经元分化的影响

目的研究神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和向神经元分化的影响,探讨转染NT-3基因的MSCs体内移植治疗脊髓损伤的可行性。方法体外培养稳定表达NT-3蛋白的MSCs,通过MTT法检测NT-3对MSCs增殖的影响;应用免疫细胞化学和免疫印迹方法检测转染NT-3的MSCs表达神经元标志物NeuN蛋白的情况。结果转染NT-3基因的MSCs生长曲线上移,细胞增殖率显著升高,与对照组相比,两者有显著差异(P<0.05),表明转染NT-3后细胞生长加快。免疫荧光染色结果显示转染NT-3的MSCs的NeuN阳性细胞数明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05);Western印迹检测结果显示转染NT-3的MSCs内NeuN蛋白表达明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05),表明NT-3促进MSCs向神经元方向分化。结论 NT-3基因转染可促进MSCs的增殖,并诱导其向神经元方向分化。

大鼠羊膜上皮细胞的生物学特性

目的探讨建立大鼠羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法及观察其生物学特性。方法从妊娠14～16 d的SD大鼠胎盘剥离羊膜,用胰蛋白酶消化法分离大鼠羊膜上皮细胞,采用免疫荧光细胞化学和流式细胞仪分析细胞表型特征;使用含有10%胎牛血清(FBS)和100 U/ml青霉素-链霉素(PS)溶液的DMEM/F-12的培养基进行细胞培养。结果每次采用胰蛋白酶消化法从1只孕鼠分离的上皮细胞数为(1～6)×105/ml,足够达到贴壁培养浓度。所分离的羊膜上皮细胞表达神经前体细胞特异性蛋白nestin和骨髓间充质干细胞表面标记蛋白CD29和CD44,但是未成熟神经元标记蛋白β-Ⅲ-tublin、星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及造血干细胞表面标记蛋白CD34表达阴性。在完全培养基培养条件下,羊膜上皮细胞生长增殖较快,原代培养1 w后即可传代。结论建立了大鼠羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定的方法,大鼠羊膜上皮细胞具有神经前体细胞的特异标志和间充质干细胞的某些表型特征。

精囊精道解剖学特点及在临床内镜手术中的指导意义

目的:通过研究精囊精道解剖学,掌握局部解剖结构,指导临床精道内镜手术。方法:收集并分析临床48例精囊镜手术资料,统计进入精囊路径方式及术后临床效果;同时选取12具成人骨盆段标本进行精囊精道局部解剖研究,并模拟手术路径。结果:解剖结果与临床术中所见相互印证,52. 1%(25/48)临床病例射精管开口无法探及,但93. 8%(45/48)临床病例可经不同途径进入精囊完成手术。结论:经尿道微创精道内镜技术治疗精道、精囊疾病是完全可行的,但仍有局限性,需要结合其他治疗才能取得更好的治疗效果。

PBL在人体中枢神经解剖学教学中的应用

介绍在人体中枢神经解剖学课程教学中实施以问题为基础的学习（problem—basedlearning，PBL）的具体方案、形式和措施。并探讨拟定讨论问题的深度与范围，在学生讨论过程中如何调动其积极性，教师在教学过程中如何注意课程知识的系统性和逻辑性，如何让学生早期接触临床，如何配套相应的考核方式等。