鼠伤寒沙门氏菌c-di-GMP结合蛋白YcgR的表达、纯化及活性鉴定

【背景】在鼠伤寒沙门氏菌中,c-di-GMP结合蛋白YcgR通过与鞭毛运动蛋白的相互作用,抑制鞭毛运动速度,使细菌由浮游生长向生物膜产生及侵染宿主的静止状态转变。然而,目前关于该蛋白的结构、功能以及与c-di-GMP结合后调控细菌运动状态的分子机制还不清楚。【目的】通过原核表达,获得高纯度的YcgR蛋白,并对其二级结构稳定性以及c-di-GMP结合活性进行表征,为进一步确定YcgR的结构以及阐明c-di-GMP如何通过结合YcgR而减缓细菌运动速度的分子机制奠定基础。【方法】通过构建重组大肠肝菌对YcgR进行原核表达;通过Ni-NTA镍离子亲和层析柱和体积排阻色谱两步纯化获得高纯度的YcgR蛋白;预测YcgR蛋白质结构,利用圆二色光谱仪(CD)测定其二级结构;通过等温滴定量热法(ITC)和热转移技术(Protein thermal shift)研究YcgR与c-di-GMP的结合活性。【结果】菌落PCR和质粒测序结果表明,表达YcgR的重组大肠杆菌构建成功;SDS-PAGE和体积排阻色谱显示YcgR的分子量大约为28 kD,在溶液中以二聚体的形式存在;通过预测和对比,发现YcgR的结构与同源蛋白PP4396高度相似,都有一个响应c-di-GMP的PilZ结构域,且CD结果显示YcgR具有稳定的二级结构;ITC和Thermal Shift结果表明,YcgR与c-di-GMP有较强的结合活性,其Kd值为50 nmol/L。【结论】首次实现了鼠伤寒沙门氏菌YcgR蛋白的原核表达及纯化,表征了其c-di-GMP结合活性,为进一步研究YcgR蛋白与细菌信号分子c-di-GMP调控鞭毛运动的分子机制奠定基础,并为鼠伤寒沙门氏菌抗感染药物的研发和治疗提供新的策略。