禽流感、新城疫可目视化诊断蛋白芯片的制备及初步应用

本研究制备了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。以超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原,用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;将芯片与待检血清杂交后,再与胶体金标记的二抗杂交,银染显色后根据灰度值判定结果,从而建立了2种禽病的可视化蛋白芯片鉴别诊断方法。采用该方法对18份现地血清样品进行初步检测,结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交,无交叉反应,而且呈现较强的杂交信号,其信号灰度值在阳性血清浓度为50μg/mL～300μg/mL范围内成线性关系(Y=0.426X+4.225)。用该芯片方法和琼扩(AGP)抗体检测方法对18份现地样品进行符合率检测,结果表明该可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且检测灵敏度为是AGP方法的400倍以上。研究表明该方法可用于同步鉴别2种禽病,是一种有效的抗体检测新方法。

致病性马兽疫链球菌的分离鉴定、生物学特性及其M-like基因的序列分析

为鉴定锦州某猪场引起关节炎病疫情的病原,本研究将患猪关节液在血平板培养基上培养进行细菌分离;对分离细菌进行形态学观察、生化反应、致病性试验及药物敏感性试验;并对其M-like基因进行克隆和测序分析。结果在显微镜下观察到周围具有透明的β溶血环的革兰氏阳性中长链球菌,经生化反应及M-like基因鉴定为马兽疫链球菌(命名为10JZ12);分离株10JZ12对小鼠的致死剂量为1.75×108cfu;并对苯唑西林、青霉素G、红霉素、克拉霉素、克林霉素、米诺环素、环丙沙星、左氟沙星、多粘菌素B、呋喃妥因敏感,对氯霉素、四环素、诺氟沙星、复方新诺明不敏感。

4种禽病毒抗体可视化蛋白芯片的制备及应用

【目的】研制可同时鉴别检测AI、ND、IB、IBD等4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。【方法】用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了4种病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;分别用4种禽病阳性血清杂交,再与金标二抗杂交,银染显色后读取结果,建立4种禽病的可视化蛋白芯片工作平台;进一步对此芯片的特异性以及灰度值与抗体浓度的相关性进行了研究;最后对18个现地血清样品进行了初步应用检测。【结果】结果显示经过条件优化后,芯片检测探针可特异性的相应的抗体进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。信号灰度值在抗体浓度为50～300μg·ml-1范围内成线性关系。用芯片和其它传统抗体检测方法同时检测18份现地样品,结果发现可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且灵敏性明显高于传统检测手段。【结论】研究表明该方法可用于同步鉴别4种禽病抗体,是一种有效的抗体检测新方法。

不对称RT-PCR结合芯片技术鉴别4种禽病的初步研究

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T/A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,鸡传染性支气管炎病毒np基因、新城疫病np基因、鸡传染性法氏囊A基因,并构建重组质粒;以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物中;并对扩增条件进行优化。研究发现检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确进行4种主要禽病的鉴别诊断和禽流感主要流行亚型鉴定,对感染样品和现地样品检测结果与RT-PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率分别为100%和96%。结果显示该方法可用于同步鉴别禽流感、鸡传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性法氏囊病,以及现地主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。

不同毒力猪繁殖与呼吸综合征病毒对仔猪肺和外周免疫器官损伤的研究

为研究不同毒力的PRRSV对仔猪肺脏和外周免疫器官损伤的差异,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4株)和PRRSV经典株(CH-1a株)感染35日龄健康的断奶仔猪,并在感染后0 d、3 d、7 d、10 d和14 d各迫杀3头,检测肺、颌下淋巴结、肠系淋巴结、腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏的病毒载量及病理变化情况,同时检测血清中抗PRRSV的抗体水平。结果表明:感染后3 d肺脏及各免疫器官可检测到病毒,HuN4感染组病毒载量比CH-1a感染组病毒载量高1 000倍;HuN4感染组病毒载量峰值出现在感染后10 d,而CH-1a感染组维持着较低水平的病毒载量。组织病理学检测显示HuN4感染组淋巴结内淋巴细胞显著减少,呈空泡状;CH-1a感染组淋巴结内淋巴细胞轻度减少,呈星隙状。本实验表明HuN4株比CH-1a株对肺和外周免疫器官造成更严重的损伤。

一株血清7型致病性猪链球菌的分离鉴定

为确定2007年11月黑龙江省五常市某猪场发病猪的病原,本研究将病猪迫杀,采取脑和关节液在血平板培养基上划线进行细菌分离培养,结果显示在血平板培养基上形成灰色、半透明、边缘整齐的有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形小菌落,镜检观察到散在排列的革兰氏阳性短链球菌,经生化反应、PCR反应及血清学试验鉴定为7型猪链球菌,并命名为07WC11株,其毒力基因型为cps7H+、gdh+、mrp+、ef-和sly-。以纯化的该分离菌株对斑马鱼和仔猪进行动物感染试验均能够导致斑马鱼和仔猪发病,表明该菌株具有一定的致病性,其毒力比国际标准菌株R735株和8074株更强。

高致病性PRRSV HuN4株Nsp4的原核表达及其抗体水平检测

为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp4的免疫学特性,本研究根据PRRSV HuN4株序列,设计并合成用于扩增PRRSV HuN4株Nsp4基因的引物。将扩增产物与原核表达载体pGEX-6P-1连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。Western blot试验显示,Nsp4在大肠杆菌中获得较高水平的表达,并且具有良好的反应活性。利用该蛋白建立ELISA方法,检测PRRSV HuN4株感染仔猪的不同时间内的血清,并比较抗Nsp4,囊膜蛋白和M蛋白,N蛋白的抗体水平,结果表明Nsp4抗体升高的时间晚于囊膜蛋白和M蛋白、N蛋白出现的时间,同时抗体水平也低于其他蛋白。

一种基于16SrRNA基因检测猪嗜血支原体PCR方法的建立

本试验目的是建立一种基于16SrRNA基因检测猪嗜血支原体的PCR方法。根据GenBank上猪嗜血支原体16S rRNA基因(ID:U88565)设计特异引物,对哈尔滨采集病料进行PCR并克隆pMD18-T,测序所扩增的片段为411bp,同源性分析表明,该序列与参考序列同源性97.57%。特异性和敏感性试验表明,所建立的PCR诊断方法对猪肺炎支原体、大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌无交叉反应;血液基因组DNA最小检出量为0.75fg/μL。该方法具有快速、特异、敏感等特点,为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段。

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp7的免疫原性,本研究将PRRSV Nsp7进行了原核表达。SDS-PAGE和western blot试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,并且其具有较好的反应活性。采用Nsp7免疫小鼠制备多克隆抗体,并进行间接ELISA检测,表明多克隆抗体效价达到1∶32 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别PRRSV的Nsp7,显示出Nsp7具有较好的免疫原性。本研究获得了高纯度可溶性的PRRSV Nsp7,并进一步制备多克隆抗体,为研究Nsp7蛋白的免疫学特性提供实验依据。

猪全血中IFN-γ、IL-2、TNF-αTaqMan定量RT-PCR方法的建立及对猪瘟疫苗的免疫评价

为建立猪相关细胞因子的检测方法,本研究针对GenBank中猪IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因设计特异性引物和荧光探针,建立了这3种细胞因子TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法在101～109拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数R2均高达0.999。利用该方法对猪瘟(CSF)活疫苗进行细胞免疫评价,结果显示,CSF疫苗免疫组猪瘟病毒(CSFV)刺激细胞相对于空白对照细胞,IFN-γ、IL-2、TNF-αmRNA表达量在免疫后3 d～10 d之间均显著升高(p<0.05),而IFN-γ在14 d仍保持高水平表达;对照组CSFV刺激细胞和空白对照细胞的3种细胞因子表达量均无明显差异(p>0.05)。以上结果表明,该方法具有高度的特异性、敏感性和重复性,对不同疫苗的细胞免疫反应评价是可靠的。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因的原核表达

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的结构、功能及免疫学特性,根据GenBank中已发表的高致病性PRRSV HuN4株ORF3基因序列,设计合成扩增PRRSV ORF3基因的引物。将扩增的基因克隆到表达载体pProEx HTb中,转化到大肠埃希菌BL21进行表达。Western blot分析表明,GP3蛋白在大肠埃希菌中获得正确表达,且具有良好的反应活性。将纯化的GP3蛋白免疫小鼠制备抗GP3多克隆血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价,结果在小鼠体内产生较高滴度的特异性抗体,证明PRRSV GP3蛋白具有良好的抗原性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7间接ELISA检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的检测方法,本研究以重组Nsp7作为包被抗原,通过优化反应条件,建立PRRSV抗体间接ELISA检测方法。该检测方法与猪瘟等常见的6种猪病毒病的阳性血清无交叉反应,显示出良好的特异性。其检测标准血清的最低稀释倍数为1∶3 200,显示出良好的敏感性。批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%,显示出良好的重复性。采用该检测方法检测400份临床血清样品,实验结果表明该方法与商品化的IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒符合率达到95.0%～96.8%;与LSI PRRSV抗体检测试剂盒符合率达到94.0%～96.5%。

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163 TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法在检测101copies/μL～108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系。标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100%和107%;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM)72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录水平显著上调。本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法。

黑龙江省部分地区鸡传染性支气管炎剖检病变调查

鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病。临床表现为咳嗽、打喷嚏、气管罗音、肾脏病变,蛋鸡产蛋数量和蛋的品质下降,雏鸡可因为感染后的呼吸道和肾脏的病变造成死亡。

猪源伪狂犬病病毒gB基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为加强对猪源伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）的监测,在PRV gB基因的保守区设计特异性引物,并建立了检测猪源PRV的实时定量PCR。该方法可检测PRV的最低TCID50为2×10^1/mL,比伪狂犬病诊断技术国家标准中的PCR方法敏感100-1 000倍,且特异性、重复性好。利用该方法测定了PRV SC株在感染Vero细胞后的复制动态;结果显示,PRV在感染后第12小时进入复制高峰期,在感染后第24小时达到平台期。本方法具有快速、敏感和重复性好等特点,能够为研究病毒的复制动态或临床样品的检测提供技术支持。