心肌梗死相关lncRNA的筛选及表达模式分析

心肌梗死严重威胁人类健康,给人类造成了沉重的社会负担.长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)主要通过表观遗传调控、转录和转录后调控、miRNA调节等方式,参与心肌细胞凋亡和心肌纤维化过程,与心肌梗死发生发展有密切关系,具有作为疾病诊断和治疗靶标的潜能.我们通过高通量转录分析策略筛选在心肌梗死组织与正常心肌组织中差异表达的lncRNA,并通过对lncRNA的生物信息学分析、生物学定位以及功能的初步探索研究lncRNA与心肌梗死发生发展的关系,以确定新的可作为心肌梗死治疗靶点的lncRNA.我们的研究为利用lncRNA治疗心肌梗死提供了线索.

CRISPR/Cas9技术联合AAV对Rosa-mTmG小鼠的MEF细胞进行编辑

目前,基因编辑技术已被广泛用于生物医学研究,本研究利用AAV(Adeno-Associated Virus)递送CRISPR/Cas9系统,实现高效率的基因编辑,并对特定组织细胞中的基因编辑进行了初步探索.我们首先采用Rosa-mTmG转基因小鼠来研究CRISPR/Cas9在小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)中的编辑效率;接着,我们构建了能够被AAV包装的SaCas9系统,并通过瞬转以及AAV介导递送的方式检测其基因编辑效率;最后,我们还构建了含有心肌特异启动子的cTNT-PX601-sgRNA以备后续研究.结果发现,与瞬转相比,AAV介导CMV-PX601-sgRNA在体外能够极大地提高细胞的基因编辑效率.另外,cTNT-PX601-sgRNA能够在心肌细胞中特异表达.我们的结果表明,利用AAV介导的CRISPR/Cas9系统在体外可以实现高效地基因编辑,为靶向修复基因缺陷疾病,特别是特定组织器官中的基因缺陷,提供了研究工具和实验依据.

miR-148/152家族调控内皮细胞糖酵解相关基因的表达分析

目的探究miR-148/152家族在多能干细胞衍生内皮细胞(ECs)中对糖酵解相关基因的调控作用。方法本研究以人胚胎干细胞(hESCs)株H1(WT)和采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的miR-148/152家族全敲除多能干细胞系(TKO)为基础;利用免疫荧光技术检测干细胞标志物NANOG的表达,评估WT和TKO干细胞的多能性;通过添加化学小分子和细胞因子如Wnt信号通路激活剂、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白4等,定向诱导hESCs向ECs分化;采用RT-qPCR检测miR-148/152家族在ECs中的敲除效率,并探究糖酵解关键酶和代谢转换关键基因在WT和TKO干细胞分化ECs中的表达差异。两组间比较采用独立样本t检验。结果与WT比较,TKO多能干细胞中miR-148a(1.00±0.03比0.00±0.00)、miR-148b(1.00±0.07比0.13±0.06)、miR-152(1.01±0.15比0.05±0.03)丰度降低,差异具有统计学意义(P均<0.001)。WT和TKO hESCs均表达核定位的多能性标志分子NANOG,且均可定向分化为CD31阳性的ECs。与WT比较,TKO ECs中miR-148a(1.00±0.05比0.00±0.00)、miR-148b(1.00±0.08比0.12±0.05)、miR-152(1.00±0.08比0.13±0.07)检测丰度降低,差异具有统计学意义(P均<0.001)。与WT比较,TKO ECs中糖酵解关键酶如磷酸甘油酸激酶(1.00±0.09比0.20±0.02)、己糖激酶(1.02±0.20比0.55±0.12)、磷酸果糖激酶(1.00±0.05比0.67±0.14)、乳酸脱氢酶(1.00±0.04比0.53±0.05)、丙酮酸激酶(1.00±0.03比0.83±0.09)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(1.00±0.03比0.59±0.09)的mRNA表达水平下调,而糖代谢向氧化磷酸化代谢转换过程中的重要基因丙酮酸脱氢酶激酶1(1.00±0.08比2.90±0.23)在敲除系中表达量升高,差异有统计学意义(P均<0.05)。与WT比较,TKO ECs中糖酵解抑制因子磷脂酶和张力蛋白同源物的表达量升高(1.01±0.11比3.83±0.81,P<0.001)。结论miR-148/152家族是调控ECs糖代谢的重要因子,可能在维持ECs糖酵解平衡,抑制其向氧化磷酸化代谢转换中发挥重要作用。