野猪源与家猪源PRRSV陕西流行毒株对仔猪的致病性试验

【目的】研究野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株对易感仔猪的致病性及发病规律,进一步弄清PRRSV变异株的病原特征及其与"猪高热病"发生的关系。【方法】选取PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原、抗体检测均为阴性的健康仔猪(40日龄)9头,随机分为3组,用家猪源Shaanxi-1及野猪源Shaanxi-2 PRRSV变异株分别感染其中一组仔猪,每头肌注6 mL,滴鼻2 mL;另一组作为阴性对照,按相同剂量和方法接种正常Marc-145细胞处理液。攻毒后各组分圈饲养,每天定时测量体温,绘制体温变化曲线,观察临床症状,记录发病情况。攻毒后采血及咽喉、眼、鼻分泌物和粪便,采用RT-PCR方法检测PRRSV、猪瘟病毒(CSFV)、PCV2、猪伪狂犬病毒(PRV)核酸,用ELISA试验及血清中和试验检测血清抗体。【结果】Shaanxi-1与Shaanxi-2攻毒组均出现体温升高及典型临床症状,但未见死亡病例;攻毒组CSFV、PCV2、PRV核酸检测均为阴性,咽喉、眼、鼻分泌物和粪便在一定时间段可检测到PRRSV核酸;PRRSV特异性抗体检测均为阳性,仅Shaanxi-2攻毒组在第35天检测到中和抗体;Shaanxi-2与Shaanxi-1相比,感染猪的体温较高,临床症状明显,病毒血症的维持时间较长,抗体水平较高。【结论】野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1 PRRSV变异株对易感仔猪具有一定的致病性,能使感染动物发病但不能致死,Shaanxi-2毒株的致病性相对较强。攻毒后第7天出现病毒血症,持续14～21 d后逐渐消退,仔猪感染PRRSV变异株后,病毒可通过鼻、眼、咽喉分泌物及粪便等排出,其中鼻分泌物排毒最早、排毒时间最长,眼、咽喉分泌物与鼻分泌物、粪便相比排毒较晚、持续时间较短。

野猪源与家猪源PRRSV陕西分离株全基因测序与遗传进化分析

【目的】研究野猪源与家猪源猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV）陕西分离株的遗传变异情况及分子生物学特征。【方法】根据VR-2332和HB-1（sh）/2002毒株序列设计引物,对2株PRRSV陕西分离毒株Shaanxi-1（家猪源）、Shaanxi-2（野猪源）全基因分段进行扩增并测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因,然后进行序列的比对分析。【结果】PRRSV Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株高度同源且均属于美洲型毒株,它们与2006年以前分离的毒株相比存在明显差异（与BJ-4株的核苷酸同源性仅为89%）,而与高致病性PRRSV（HP-PRRSV）保持较高的同源性（相似率为99%左右）。Shaanxi-1、Shaanxi-2分别呈现不同的变异特点,Shaanxi-1 ORF3、ORF5基因变异较大,ORF6、ORF7较为保守;Shaanxi-2 ORF7基因变异最大,ORF3~ORF6较为保守。分析发现,Shaanxi-1、Shaanxi-2具有HP-PRRSV的分子特征,但部分位点氨基酸的突变明显区别于HP-PRRSV。【结论】不同来源的Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株均属于HP-PRRSV演化中的一个分支,但其发生了部分变异,使其具备了新的特点。

鸽源新城疫病毒陕西分离株P基因的克隆及序列分析

【目的】对鸽源新城疫病毒（NDV）陕西分离株P基因进行克隆和序列分析,为研究P基因及V基因的功能奠定基础,并为防治新城疫提供科学依据。【方法】参考GenBank发表的NDV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因的全长片段,并进行克隆、序列测定和分析。【结果】NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因全长1 451 bp,其完整的ORF长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。同源性比较可知,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与其他分离株P基因的核苷酸序列同源性在63.6%~92.9%,推导的氨基酸序列同源性在67.7%~92.2%。系统发育进化树表明,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与鸽源分离株P68亲缘关系最近,与F48E9和La Sota毒株处于进化树的不同分支。【结论】NDV/Pigeon/ShX/China/2003与国内外已报道的NDV毒株间存在较大变异。

牛支原体TrxR胞内抑制EBL细胞凋亡的研究

为研究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)在EBL细胞内表达对其凋亡的影响,参照GenBank中Mb Hubei-1 TrxR序列设计引物,以Mb武威分离株基因组为模板,利用PCR扩增获得Mb TrxR基因,进而构建真核表达载体pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR,并将其转染至EBL细胞内表达,然后用MTT法和流式细胞术分析Mb TrxR表达对EBL细胞增殖和凋亡的影响,用试剂盒检测分析EBL细胞中H_(2)O_(2)含量的变化。结果显示,Mb TrxR基因全长924 bp,成功在EBL细胞内表达;且该蛋白能促进EBL细胞增殖,抑制其凋亡;TrxR表达降低了EBL细胞内H_(2)O_(2)的含量。表明TrxR表达对EBL细胞的凋亡具有抑制作用,有利于EBL细胞的生长。研究结果为Mb TrxR生物学功能的深入研究积累了数据资料。

O-KEPT教学模式的构建及在生物化学课程教学中的实践

教学过程要做到课程的专业性、教学过程的包容性、教学组织的有序性和教学效果的有效性,就要采取“以学生为中心”教育理念和教学方法,结合“新农科”背景下高校生物化学课程混合式教学的探索实践,构建O-KEPT教学模式,阐述O-KEPT教学模式的内涵和要求,并结合生物化学课程教学,阐述O-KEPT教学模式指导下的教学设计、实践流程、评价方式、教学效果和普适性等,为践行有效教学、探索教学创新、打造一流课程等提供参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选

本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA)。采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3′非编码区(3′utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3′utr的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK-utr,同时合成预测到的miRNA(ssc-miR-323、ssc-miR-105-1)及其相应的抑制物,共转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),检测双荧光素酶活性。结果发现,ssc-miR-323与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率略有升高,ssc-miR-105-1与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率降低。初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3′utr没有抑制作用,而ssc-miR-105-1对PRRSV3′utr有一定的抑制作用。

抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2单克隆抗体的制备

【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,通过GST亲和层析法纯化GST-Atac2融合蛋白。以GST-Atac2为抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株,检测抗体的特异性、效价和亚型,并检测其亲和常数。【结果】PCR扩增获得了目的片段。成功构建了GST-Atac2融合蛋白表达载体,于37℃下220r/min振摇5h,当IPTG终浓度为0.1mmol/L时,GST-Atac2在E.coli BL21(DE3)中高效表达,GST-Atac2融合蛋白大小约为30ku,与预期结果一致。获得1株稳定分泌抗Atac2抗体的杂交瘤细胞株,命名为1C7。单抗1C7能够特异地识别GST-Atac2蛋白,效价为1∶2×105;亚型鉴定表明其重链为IgG1,所得单克隆抗体的亲和常数为2×105。【结论】获得了1株特异性好、能够稳定分泌抗果蝇Atac2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

牛支原体NOX2的原核表达及黏附特性

旨在探究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)NADH氧化酶NOX2的生物学功能,本研究参照GenBank中Mb湖北分离株(Mb Hubei-1 strain)nox2基因序列设计引物,应用PCR扩增获得Mb临洮分离株的nox2基因,在测序及序列优化的基础上,构建原核表达载体pET-nox2,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,进而对表达产物rMbNOX2的酶促活性、免疫原性,NOX2在Mb内的分布,rMbNOX2抗血清的补体介导体外杀菌活性和对Mb黏附宿主细胞的抑制活性进行了分析。结果表明,Mb临洮株nox2基因全长1350 bp,与GenBank中已知序列的Mb nox2基因序列比较,除Mb JF4278株相似性为97.93%外,其余均为99.93%。SDS-PAGE结果显示,优化的nox2基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白rMbNOX2相对分子质量约为67 ku,且具有良好的酶促活性;ELISA与Western blot结果显示,rMbNOX2具有良好的免疫原性,且Mb NOX2在细胞浆中的分布多于细胞膜;补体介导的体外杀菌试验及黏附抑制试验证实,rMbNOX2抗血清具有明显的补体介导杀支原体活性,并可有效抑制Mb对宿主细胞的黏附。本研究为深入探讨Mb NOX2生物学功能奠定了基础。

牛支原体武威分离株丙酮酸激酶基因的原核表达及其表达产物的功能检测

为研究牛支原体(Mb)威武分离株丙酮酸激酶(PK)的生物学功能,本研究采用PCR扩增Mb武威分离株PK基因(pyk),在测序的基础上利用over-lap PCR将Mb pyk基因中色氨酸密码子(TGA)突变为可在大肠杆菌中表达的同义密码子TGG,进而构建原核表达质粒pET-pyk并转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE检测,结果显示重组蛋白His-PK以可溶性形式表达,且其相对分子质量约为57 ku。纯化该重组蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,采用western blot分析了PK在Mb细胞内的分布,并采用补体依赖的细胞毒试验和粘附及粘附抑制试验分别检测His-PK抗血清介导的补体杀Mb作用及His-PK抗血清对Mb粘附胎牛肺细胞(EBL)的抑制作用,结果表明Mb PK在细胞膜及细胞质中均有分布,且His-PK抗血清具有明显的介导补体杀灭Mb作用和抑制Mb对EBL的粘附作用。本研究为进一步探究Mb的生物学功能奠定了基础。

兽医传染病学教学中临床思维的培养

动物医学专业教育的根本目标是培养合格的兽医师,而临床思维能力的培养和训练是达成此目标的关键,因而应将其贯穿于动物医学专业教育教学的全过程.作为动物医学专业的核心课程之一,兽医传染病学既是预防兽医学的核心主干课程,也是临床兽医课程体系的重要组成部分.因此,兽医传染病学教学过程中临床思维的培养,将直接关系到学生综合素质的提高,并最终影响到人才培养的质量.本文探讨了兽医传染病学教学中学生临床思维能力的培养,以期为促进教学改革,提高教学效果,提升教学质量,并最终培养合格的兽医师奠定基础.

基于THEOL平台的生物化学课程混合式教学改革实践

生物化学是生命科学领域最重要的基础课程之一,课程知识点多,学习难度大。而信息和网络技术的发展为高等教育改革带来了新的机遇和挑战,“清华教育在线(Tsinghua education online,THEOL)”网络教学平台为该课程的混合教学改革提供了新的契机。探讨了在使用THEOL教学平台进行生物化学混合式教学改革实践中的一些经验和体会,系统总结了THEOL教学平台在推动教学理念的创新变革、保证教学知识的实时更新、提高学生的主动性和参与性、促进综合性学习、实时跟踪课后学习、推动课程考核方式的改革、促进网络资源整合利用、促进课题组教师之间的交流共享和资源互通等方面的优势。实践教学中,基于THEOL平台的混合式教学能有效促进大学生思考,提高大学生发现问题、分析问题和解决问题的能力。旨在为生物化学课程的进一步改革研究提供依据。

1株林麝源绿脓杆菌的分离鉴定及全基因组序列分析

旨在确定甘肃省天水市某林麝养殖场致死林麝的病原菌,并开展其致病性和耐药性研究及全基因组序列分析。采集病死林麝肺,通过细菌的分离纯化、生化鉴定和16S rRNA基因序列分析,对分离菌进行鉴定;随后对其致病性和药物敏感性进行分析,并在分离菌全基因组测序的基础上,对分离菌全基因组序列进行组装和注释,对毒力基因toxA和exoT进行遗传进化分析。结果表明,从病死林麝肺中分离到一株绿脓杆菌,命名为TS2019。致病性试验测得分离菌对小鼠的LD_(50)为2.82×10^(7)CFU·mL^(-1);药敏试验结果表明,TS2019具有多重耐药性,但对环丙沙星、洛美沙星等药物敏感。基因组测序表明,TS2019基因组全长为6308327 bp,编码5929个基因,其中有1035个编码产物参与新陈代谢途径;全基因组中有毒力因子编码基因875个,产物有黏附蛋白、调控因子、毒性蛋白等;有四环素类、氨基糖苷类等抗生素耐药相关基因5288个。遗传进化分析表明,TS2019毒力基因toxA、exoT与GenBank中绿脓杆菌众多菌株相应基因序列相似性均高于99%,其中eoxT基因与中国杭州人源分离株P33的遗传关系最近,但处于独立分支。本研究从病死林麝肺分离鉴定到一株绿脓杆菌,并证实该菌有较强致病性和多重耐药性,其毒力基因toxA和exoT与GenBank中绿脓杆菌相应基因序列具有高度相似性。研究结果为林麝绿脓杆菌感染相关疾病的防治提供了理论支持,也为绿脓杆菌致病机制和耐药机制的深入研究奠定了基础。

“以学生为中心” 的生物类专业课程在线教学设计与实践

为了实现“教学标准不降低,教学效果不打折”的要求,进行“以学生为中心”的在线教学设计与实践,探索“网络课程学习为主+网络直播教学为辅+翻转式教学为提升”相结合的教学模式,通过摸索和优化直播教学效果、构建系统的网络课程学习社区、探索和创新翻转式在线教学相结合的方式,取得了良好的实践效果。“以学生为中心”的在线教学设计实践有助于推动信息化教育的发展,也为优化和改进线下教学、提升高校教师的教学设计能力提供了参考。

滑液支原体WVU1853株热不稳定延伸因子的表达及黏附特性分析

旨在探究滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)热不稳定延伸因子(elongation factor thermo unstable,EF-Tu)的黏附特性。参照GenBank中MS WVU1853株EF-Tu序列,设计引物对Tu-F/Tu-R,利用PCR扩增获得MS EF-Tu基因后,将其克隆入pET-28a(+)构建重组质粒pET-EF-Tu,继而转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导表达。纯化表达产物免疫新西兰兔制备抗血清,进而利用Western blot、ELISA和免疫荧光试验分别分析重组蛋白的免疫原性及EF-Tu在MS中的分布,利用补体介导的杀菌试验分析重组蛋白抗血清的补体介导杀支原体活性,利用黏附及抑制试验分析EF-Tu的黏附特性。结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,其相对分子质量约43 ku,并具有良好的免疫原性,其抗血清具有补体介导的杀支原体活性;EF-Tu在MS的细胞膜和细胞质中均有分布,且是MS的一种黏附相关蛋白。EF-Tu是MS膜表面黏附相关的免疫原性蛋白,研究结果为深入研究MS EF-Tu生物学功能奠定了基础。

牛支原体P48蛋白诱导EBL细胞增殖和凋亡的研究

试验旨在研究牛支原体P48蛋白对胎牛肺(embryonic bovine lung,EBL)细胞增殖和凋亡的影响。收集不同时间段、不同浓度P48蛋白与EBL细胞共孵育的样品,通过MTT法检测细胞增殖率;DAPI染核法观察EBL细胞核形态变化;流式细胞技术检测该蛋白诱导EBL细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测凋亡标志物的mRNA相对表达变化;Western blotting方法检测Bax和Beclin-1蛋白表达水平。结果显示:当作用时间为72 h,P48蛋白浓度在10μg/mL时,对EBL细胞增殖有极显著的抑制作用(P<0.01),在0.1和0.5μg/mL时对EBL细胞的增殖的抑制作用不显著(P>0.05);经蛋白诱导12 h细胞核形态未有明显变化,24 h细胞核形态发生皱缩和凝聚,48和72 h细胞核发生碎裂;凋亡标志基因mRNA表达在2和12 h没有明显提高,在24、48、72 h有显著提高,与作用时间呈正相关,同时凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达随之显著提高。流式细胞技术结果显示P48蛋白诱导EBL细胞凋亡率为48.44%。综上表明,牛支原体P48重组蛋白能够抑制EBL细胞的增殖,促进细胞凋亡,为进一步揭示牛支原体的致病机制提供参考依据。

滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位

为了解滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD)的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a(+)质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠(pNPP)转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb 2+具有较强的抑制作用,而Ca 2+对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶160 000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。

滑液囊支原体感染对鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响

为研究滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染对鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响,试验以蛋鸡卵泡颗粒细胞为模型,进行MS感染,用ELISA孕酮检测试剂盒检测鸡卵泡颗粒细胞培养上清孕酮量的变化,用qRT-PCR方法和Western blot方法检测细胞孕酮分泌相关基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果显示:随着MS感染鸡卵泡颗粒细胞时间延长,细胞分泌孕酮的水平逐渐下降;调控孕酮分泌的关键基因(FSHR、STAR、3β-HSD)mRNA表达水平和蛋白表达随着MS感染鸡卵泡颗粒细胞时间的增长而降低。结果表明,MS感染会抑制鸡卵泡颗粒细胞孕酮的分泌水平,使孕酮表达相关基因mRNA和蛋白表达水平降低,初步解释了MS感染造成蛋鸡产蛋率下降的原因。

猫ω干扰素和γ干扰素的可溶性原核表达及纯化

旨在克隆到猫ω干扰素和γ干扰素(FeIFN-ω和FeIFN-γ)基因的基础上,分析它们的一些生物学特性,并进行可溶性原核表达和简化纯化工艺,为后期作为抗病毒药物的开发奠定基础。根据GenBank登录的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因序列,对其编码氨基酸的信号肽序列进行分析,设计引物用于克隆不包含信号肽的成熟蛋白基因序列,分别插入到原核表达载体pET28a-SUMO,转化入BL21感受态细胞进行表达,并通过不同的诱导时间、温度和控制IPTG浓度优化其表达条件,在纯化阶段摸索简易工艺。结果表明,FeIFN-ω基因编码区长591 bp,共编码196个氨基酸,信号肽序列为前23位氨基酸;FeIFN-γ基因编码区长504 bp,共编码167个氨基酸,信号肽序列为前20位氨基酸。将克隆到的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因通过Bam HⅠ和Hin dⅢ酶切位点带入到含SUMO标签的原核表达载体,构建成功的重组质粒分别命名为pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ。优化条件后表明SUMO-FeIFN-ω融合蛋白在IPTG终浓度为0.6 mmol/L时,16℃诱导6 h表达量最高;SUMO-FeIFN-γ融合蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L时,16℃诱导9 h表达量最高。最终表达出均以可溶性形式存在的两种融合蛋白,经镍柱纯化,用SUMO蛋白酶去除标签和经两次截留柱纯化获得不含标签的干扰素,分子质量约18 ku和17 ku,与预期大小相符,表明FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白成功得到表达和纯化。

卵泡颗粒细胞在鸡蛋形成过程中的作用

鸡蛋在发育的早期是由性成熟的母鸡卵巢上大小不一的卵泡发育而来的,卵泡发育成熟之后排出卵子,即排出卵黄,卵黄脱离卵巢后进入输卵管,通过漏斗部、膨大部、峡部、子宫部和阴道部,随后形成蛋白、膜和蛋壳。卵泡颗粒细胞是来源于鸡卵泡内的上皮细胞,可以合成多种生长因子和激素来调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟,对卵泡形成和发育过程起重要的支持作用。在卵泡形成和发育过程中,颗粒细胞会形成一个多层次的细胞网络,与卵泡进行密集的细胞间信号转导以及大量的物质交换,可见颗粒细胞在卵巢功能中具有重要的作用,即在鸡蛋的形成过程中起着非常重要的作用。因此,该论文综述了卵泡颗粒细胞分泌的各种激素和生长因子对鸡蛋形成初级阶段的影响,为了解鸡卵泡的发育过程和调控机制、提高母鸡的产蛋性能提供一定的理论基础。

蛋鸡生产中滑液囊支原体病的危害及防治

鸡滑液囊支原体病是鸡场常见传染病之一,主要在鸡群内部传播,引发关节疾病和上呼吸道疾病。滑液囊支原体感染还会影响蛋鸡产蛋,是侵害蛋鸡机体、影响产蛋的众多因素之一。文章综述了蛋鸡滑液囊支原体病的症状、危害、预防和治疗方法,希望为后续其他此方面研究及该病的防控措施制订和药物研发提供参考。