八年制医学生神经生物学教学探索与实践

医学八年制教育模式目标是培养高素质复合型人才,针对八年制医学生基础好、起点高、学习能力强等特点,以培养学生的科研思维能力为最高宗旨,在神经生物学教学内容、方法和手段上进行探索和实践。

成年大鼠视网膜中脑红蛋白表达的亚细胞分布

目的:电镜下观察正常成年大鼠视网膜中脑红蛋白(Ngb)的表达。方法:用电镜免疫金-银细胞化学法研究Ngb在成年大鼠视网膜中的亚细胞定位。结果:Ngb在视网膜除外核层和视锥视杆层的外节段以外的其它各层均有分布。在细胞层Ngb定位于细胞的胞质内,线粒体周围多见,内质网和高尔基复合体的管腔外侧也可见Ngb阳性着色;在丛状层Ngb分布于突触前成分的突触小泡之间。结论:Ngb的特殊亚细胞分布提示其与神经元供氧的紧密关系。

依托咪酯对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察依托咪酯(ET)对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(RGC)存活的作用。方法:成年雌性SD大鼠42只,眶内距视神经根部1mm处切断左侧视神经,残端留置浸有荧光金(50g/L)的明胶海绵逆行标记RGC。术后大鼠随机分为ET(4mg/kg,ip,1次/d)治疗组、1,2-丙二醇(PG)溶剂对照组、生理盐水对照组和正常对照组。再根据术后不同存活时间将前3组动物分为7d和14d两个亚组,正常对照组动物则存活2d。于相应存活时间点处死动物,取出各组大鼠左侧视网膜平铺后计数存活RGC并得出RGC的平均密度。结果:术后7dET治疗组存活RGC平均密度为1307±55/mm2,显著高于PG对照组(1128±75/mm2)和生理盐水对照组(1068±75/mm2,P<0.001)。然而,未能在术后14d观察到ET的这种保护作用,因为ET治疗组存活RGC平均密度(210±36/mm2)与PG对照组(215±20/mm2)和生理盐水对照(208±19/mm2)间无显著差异(P>0.05)。结论:ET在视神经切断后一定时期内对RGC具有神经保护作用。

EGCG对过氧化氢所致神经元过氧化损伤的保护作用

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酚(EGCG)对过氧化氢(H2O2)所致神经元过氧化损伤的保护作用。方法分离胚胎18d大鼠大脑皮质神经元,原代培养2d后分为4组:①正常细胞对照组;②药物对照组(正常细胞内加EGCG);③氧化损伤组(正常细胞内加H2O2);④损伤后药物治疗组(氧化损伤30min后加入EGCG)。各组细胞再培养36h后,进行神经元形态观察、细胞活性MTT分析及细胞中丙二醛(MDA)含量的检测。结果氧化损伤组神经元多崩解成碎片,突起不完整,细胞活性显著降低,MDA含量显著升高。而在损伤后药物治疗组,神经元胞体立体感较强,多数突起完整。细胞活性显著增高,而MDA含量则显著下降。结论EGCG可抑制羟基自由基的产生。

肌苷毫微粒对成年大鼠视网膜节细胞的保护作用

目的 研究载有肌苷的毫微粒对视神经切断后视网膜节细胞(RGC)存活的影响。方法 制备肌苷毫微粒,体外测定理化性质。将等体积的肌苷毫微粒、空载毫微粒或生理盐水溶液分别注入成年大鼠左眼内,对照组未经任何治疗。1d后于眶内切断所有动物左侧视神经,术后7d取左视网膜,计数荧光金逆行标记的存活RGC。结果 肌苷毫微粒形态规整,具有缓释特点。同对照相比,肌苷毫微粒能显著提高存活RGC的密度,而空载体和生理盐水无此作用;空载毫微粒与生理盐水、对照之间以及空载毫微粒和肌苷毫微粒两组间RGC密度均无显著差异。结论 注入眼球的肌苷毫微粒至少在7d内能有效缓释肌苷,进而对轴突损伤RGC发挥显著的神经保护作用。

两种不同纯度的嗅鞘细胞在体外存活与生长的比较

比较80%和50%两种纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用最佳纯度提供依据。分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%和50%的比例混合后接种,继续培养1d或3d。所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学荧光染色,以鉴定嗅鞘细胞的初始及其后培养过程中数量和纯度的变化。观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞数目,求得各组嗅鞘细胞数量和纯度并行统计学分析。结果显示:两种不同纯度嗅鞘细胞在培养1d时形态正常,3d时纯度为50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降。而纯度为80%的嗅鞘细胞在培养3d时已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(P=0.02),但纯度未发生明显变化。结果表明50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于80%者,提示细胞体内移植时应考虑选取50%纯度的嗅鞘细胞。

嗅鞘细胞在冻融的周围神经移植物中的存活及分布

目的:观察嗅鞘细胞在成年大鼠视神经眶内断端移植的冻融周围神经中存活、生长与分布随存活时间的变化及对视神经再生的影响。方法:取成年大鼠坐骨神经反复冻融后,自两端注入10μL嗅鞘细胞悬液(105/μL),再移植于同种异体动物经眶内切断的视神经眶内断端上,分别于术后2d;1,2,3及4wk取移植物,切片观察嗅鞘细胞在其中的存活、生长及分布,并计数术后3,4wk动物视网膜内经移植物远端以50g/L荧光金逆行标记的再生视网膜节细胞。结果:嗅鞘细胞自注射部位增殖并迁移至周围神经全段,2wk时数量达到高峰,3,4wk时仅见神经周边部位残存极少量嗅鞘细胞,且视网膜内未见任何轴突再生的视网膜节细胞。结论:嗅鞘细胞可在冻融周围神经移植物中存活2￣3wk,神经周边部位较实质内更有利于嗅鞘细胞生长,这种移植物不能发挥促进视神经再生的作用。

地西泮对大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞保护作用的研究

目的探讨地西泮对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)的保护作用及机制。方法取雌性SD大鼠36只,随机平均分为2组,麻醉后于眶内距视神经根部1.5 mm处切断左侧视神经,眶侧残端留置浸有荧光金的明胶海绵以逆行标记RGC。术前30 min及术后每天腹腔注射地西泮(地西泮组)和生理盐水(对照组),分别于术后2 d、7 d及14 d各处死6只大鼠。根据上述实验结果,将另外24只大鼠平均随机分为2组,每天腹腔注射γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体阻断剂荷苞牡丹碱(荷苞牡丹碱组)和荷苞牡丹碱+地西泮(联合应用组)以探讨地西泮的神经保护机制,2组在动物存活2 d及7 d后分别处死6只大鼠。动物处死后视网膜平铺,计数每只动物荧光金标记的存活RGC并得出存活RGC的平均密度。比较各组RGC密度。结果地西泮组视神经切断后7 d RGC平均密度(1 730±75)mm-2显著高于同一时间点对照组RGC密度(1 095±94)mm-2。在此时间点,联合应用组RGC密度(1 120±63)mm-2明显低于地西泮组,而荷苞牡丹碱组与对照组RGC密度差异无统计学意义(P>0.05),说明地西泮对RGC的保护作用可被荷苞牡丹碱拮抗。结论地西泮可通过激活GABAA受体的途径在大鼠视神经切断后7 d促进RGC的存活。

不同穴位和频率的电针刺激对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞存活的作用

目的:研究不同穴位和频率的电针刺激对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(节细胞)存活的作用。方法:54只成年SD大鼠接受右侧视神经眶内切断术及节细胞荧光金(Fluoro Gold,FG)逆行性标记后,随机分为9组,对照组(含2、7、14 d组)及不同穴位、频率和伤后存活时间组合的电针组(含假穴4/20 Hz电针7 d组、百会穴4/20 Hz电针7 d组、睛明穴2 Hz电针7 d组、睛明穴4/20 Hz电针2、7、14 d组),每组6只动物。结果:(1)睛明穴4/20 Hz电针7 d组存活节细胞平均密度显著高于对照、假穴和百会穴组(P<0.01),而假穴和百会穴组与对照组间无显著性差异;(2)睛明穴2 Hz与睛明穴4/20 Hz电针7 d组节细胞密度虽无显著性差异,但均显著高于对照7 d组(P<0.01);(3)分别以4/20 Hz电针刺激睛明穴2、7、14 d,与对照组相同时间点相比,仅在伤后7 d出现节细胞密度的显著增高(P<0.01)。结论:以4/20 Hz与2 Hz两种不同频率的电针刺激睛明穴,均能在成年大鼠视神经切断后7 d延缓节细胞的死亡。就本研究所观察的不同穴位和频率而言,电针的神经保护作用取决于针刺穴位而非电针频率。

成年大鼠视神经夹伤后TLR4与GAP-43表达时程的比较

目的明确视神经损伤引起的固有免疫应答反应与视网膜神经节细胞轴突再生之间的时间关系。方法：将成年SD大鼠随机分为视神经损伤组与假手术对照组，损伤组动物左侧视神经以钳夹法损伤，对照组仅暴露左侧视神经。手术第1、3、7 d处死后取左侧视神经干，用Western Blot方法检测视神经干toll样受体4（toll-like receptor4，TLR4）和生长相关蛋白-43（growth—associated protein-43，GAP-43）蛋白表达水平。结果：视神经干内TLR4和GAP-43蛋白在损伤后第1 d都趋于表达上调，但其后的变化趋势具有不同的时间特征，即TLR4持续上调，并在损伤后7～14 d内维持呈平台；而GAP-43的表达在损伤后第7 d呈峰值，其后逐渐下降，第14 d基本恢复至基线水平。结论：TLR4介导的固有免疫应答有可能影响视神经再生；TLR4和GAP-43表达变化的不同为进一步研究固有免疫应答对视神经再生的影响提供了有益的线索。

不同剂量氯化锂对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞的保护作用

目的:研究不同剂量氯化锂(LiCl)对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(RGCs)存活的作用。方法:眶内切断72只成年雌性SD大鼠左侧视神经且残端留置荧光金(FG)后,随机分为生理盐水对照组和低剂量(30 mg/kg/d)、中剂量(60 mg/kg/d)、高剂量(85 mg/kg/d)氯化锂实验组。术前1 d及术后每天腹腔注射生理盐水或不同剂量的氯化锂溶液,直至术后2 d、7 d或14 d处死动物。平铺视网膜后取样计数FG逆行标记的存活节细胞,并由此计算出每一视网膜内节细胞的平均密度。结果:术后2 d各剂量氯化锂组节细胞平均密度与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。当存活时间增至7 d时,各剂量氯化锂组节细胞密度均明显高于对照组(P<0.01),且中剂量组节细胞密度增高最为显著。术后14 d时,低剂量与中剂量组节细胞密度仍显著高于对照组(P<0.01),但高剂量组节细胞密度与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论:腹腔内注射氯化锂可显著促进成年大鼠视神经切断后节细胞的存活,这种神经保护作用为剂量依赖性。

不同给药途径的聚乙二醇对大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞存活的影响

目的:比较不同给药途径的聚乙二醇(PEG)对成年大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞(节细胞)存活的影响。方法:72只成年SD大鼠左眼球后1.5 mm处横断视神经,眶侧断端留置浸有荧光金的明胶海绵以逆行标记存活的节细胞。术后立即尾静脉注射1 ml 30%PEG(尾静脉注射PEG组)或等体积生理盐水(尾静脉注射盐水对照组),或在视神经眶侧断端留置浸有50%PEG(局部PEG组)或生理盐水(局部盐水对照组)的明胶海绵。四组动物(n=18)分别存活2、7 d或14 d(每时间点,n=6)后处死,取术侧视网膜,平铺计数存活节细胞并计算出节细胞密度。结果:术后7 d尾静脉注射PEG组存活节细胞平均密度(1121.43 mm2±42.69/mm2)显著高于尾静脉注射盐水对照组(846.67/mm2±58.19/mm2,P<0.05),而2 d和14 d时间点两组节细胞密度间无显著性差异(P>0.05);局部PEG组节细胞密度在各时间点与局部盐水对照组相比均无显著性差异(P>0.05);在7 d点,尾静脉注射PEG组节细胞密度显著高于局部PEG组(774.43/mm2±50.49/mm2,P<0.05)。结论:PEG能在视神经切断后一定时间内延缓节细胞死亡,且这种神经保护作用有赖于PEG的给药途径。

意思自治原则在合同法中的应用

本文认为 ,九届人大二次会议通过的新的《合同法》首次全面地确立了当事人意思自治的原则 ,并在合同的订立、解除以及合同效力处理等具体规定中得到了充分的体现 ,适应了市场经济的发展。贯彻意思自治原则 ,既是对合同当事人的要求 ,也是对政府主管部门、司法机关和仲裁机构处理合同纠纷工作的要求。

嗅鞘细胞移植对成年大鼠损伤视网膜神经节细胞的保护作用

在脊髓损伤区内移植嗅鞘细胞可保护皮质脊髓束和脑干神经元，但嗅鞘细胞对邻近感觉神经元胞体的近距离轴突损伤是否具有保护作用尚待研究。因为不同类型神经元对损伤的反应各异，且轴突损伤距神经元胞体越近则神经元死亡越多。

人参皂甙Rd在神经损伤中的保护作用

人参皂甙Rd(GSRd)是人参皂甙的主要活体单位之一,具有保护心血管功能、抗肿瘤、调节免疫等药理作用。近年研究发现,GSRd具有神经保护作用。在神经损伤的过程中,GSRd通过减轻神经元的氧化应激、稳定线粒体膜电位、抑制兴奋性氨基酸介导的Ca2+内流、抑制炎症反应及促进神经突生长等途径,减轻神经元损伤,抑制神经元凋亡,发挥了神经保护作用。本文主要从GSRd在脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化和脊髓损伤中的神经保护效应等方面,结合大量的体内、体外实验的研究结果,具体阐述GSRd发挥神经保护作用的可能机制,并且通过对GSRd的临床试验阶段的分析,阐述其具有确切的神经保护作用以及良好的药物安全性。

移植含嗅鞘细胞和体外溃变的周围神经对成年大鼠视网膜神经节细胞轴突再生作用的比较

目的比较含嗅鞘细胞（OEC）或（和）体外溃变的周围神经移植对成年大鼠视网膜神经节细胞（RGC）轴突再生的影响。方法将24只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组，每组各6只大鼠：A组（周围神经对照组）：将取出的一段自体坐骨神经与眶内切断的左侧视神经近侧断端吻合；B组（OEC注入周围神经组）：自取出的坐骨神经两端注入10μlOEC悬液后移植于视神经断端。C组（周围神经体外溃变组）：将取出的坐骨神经在体外单独培养5d后植于视神经断端；D组（OEC-周围神经共培养组）：将取出的坐骨神经与OEC共培养5d后植于视神经断端。移植术后4周处死动物，计数各组以5%荧光金逆行标记的再生RGC数量。结果B、C、D三组RGC均数1481±268、1235±266和1464±285显著高于A组799±109（P值分别为0.0002、0.0010和0.0003）；B、C、D三组间差异无统计学意义（P值分别为0.3644、0.9167和0.4344）。结论OEC具有促进RGC轴突在新鲜周围神经移植物中再生的作用，但这种作用与体外溃变的周围神经相比无明显差异，二者亦无协同作用。

发挥多媒体教学优势 提高神经生物学教学效果

神经科学(或脑科学)于20世纪70年代迅速崛起,作为神经科学主体的神经生物学已成为生命科学中发展最迅速的前沿科学之一。神经生物学是研究人和动物的神经系统的科学,揭示人类的感觉、运动、思维、情感、行为、学习记忆等各种神经活动的基本规律,在分子、细胞和整体水平阐明其机制,就是神经生物学的基本内容。由于本学科内容丰富,信息量大,专业性强,有别于生理、病理、生化等传统课程内容,如何在有限的学时内高质量地完成教学任务,成为每个教师面临的主要问题。经过总结历年研究生教学的经验,参考其他教研室的教学实践,笔者认为,在传统的课堂授课基础上,充分发挥多媒体教学的优势,有助于提高神经生物学教学效果。具体主要从三个方面开展:①课前精心准备多媒体课件;②重视课堂授课效果;③拓宽学习途径,开展网络教学。

图像分析与人工计数视网膜神经节细胞方法的比较

目的 探讨图像分析仪计数视网膜神经节细胞 (retinal ganglion cell,RGC)的特点和实际应用的可能性。 方法 自眶内切断 18只成年大鼠左眼视神经 ,近侧断端留置浸有 5 %荧光金的明胶海绵。分别于手术后 2、7、14 d处死动物 ,每一时间点各 6只。取左眼视网膜经后固定平铺于载玻片上 ,荧光显微镜下分别以人工视网膜分区取样估测法和 Quantimet5 70图像分析仪计数荧光金逆行标记的 RGC。 结果 RGC数目随手术后存活时间延长而下降 ,手术后 2、7、14 d图像分析仪和人工计数法计数的 RGC总数分别为 (12 0 6 6 3± 90 89)、(5 92 85± 170 71)、(1780 2± 1984 )个 / mm2 和 (1182 37± 7898)、(5 76 4 8±14 5 33)、(180 70± 14 6 1)个 / mm2 ,同一时间点两组间计数结果差异无显著性的意义 (P>0 .0 5 )。 结论 图像分析仪计数 RGC具有较为简便、客观和可重复计数的特点 ,可用于计数 RGC的实验研究。