新城疫病毒F基因的克隆表达及重组蛋白的反应原性分析

为分析新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)及其突变体(Fm)基因的反应原性,以携带有NDV-F和NDV-Fm基因的质粒为模板设计引物,PCR扩增产物经双酶切后分别连入原核表达载体pET-SUMO、pET-28a,构建重组质粒pET-SUMO-F、pET-28a-Fm,将重组质粒转化入宿主菌Rosetta 2感受态细胞,在IPTG诱导下表达。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,NDV-F和NDV-Fm在原核系统中表达后分别获得了相对分子量为64.7 kD和48.7 kD的重组蛋白;重组蛋白能被抗NDV鸡阳性血清识别。试验表明,NDV-F和NDV-Fm可以在原核系统中表达,且具有良好的反应原性。

猪链球菌Ide通用截短蛋白原核表达及纯化研究

为利用大肠埃希菌表达猪链球菌Ide通用截短蛋白,通过对Gen Bank公布的Ide S蛋白家族基因同源性分析,使用Primer 5.0软件设计一对特异性引物,以猪链球菌2型强毒株JZLQ全基因组为模板,采用PCR方法扩增Ide基因截短片段,经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后将目的片段分别克隆到p ET28a、p ET32a和p ET-sumo表达载体上,分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)。通过优化诱导温度及诱导剂IPTG浓度进行表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,PCR扩增片段大小约为1200 bp,经双酶切和测序验证构建正确;三种重组表达载体转化大肠埃希菌后均有目的蛋白表达,但不同表达条件下目的蛋白表达量存在差异,其中p ET28a-Tr Ide重组表达载体用25℃诱导、IPTG终浓度为1 mmol/L时可实现重组蛋白的高效可溶性表达,为IdeSsuis蛋白在猪链球菌通用疫苗研发方面的研究奠定了基础。

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性双价纳米抗体原核表达及活性鉴定

以猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VHH_(cap)基因为模板,通过PCR分别克隆下游片段VHH_(down)和带(G_(4)S)_(3)-linker接头序列的上游片段VHH_(up),通过两步酶切连接反应,将VHH_(down)片段插入到pCold-SUMO载体中构建VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒,再将VHH_(up)片段插入到构建成功的VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒中,构建双价单特异性纳米抗体原核重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,表达产物经Ni^(2+)亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE鉴定;通过间接ELISA方法测定纯化后的双价纳米抗体重组蛋白biVHH_(cap)的效价水平,并与相同浓度的单价纳米抗体蛋白VHH_(cap)的ELISA效价进行比较分析。结果表明,重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO构建正确,Cap蛋白双价单特异性纳米抗体重组蛋白在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为45 ku;该双价纳米抗体与其单价组分相比,ELISA抗体效价提高约20倍,Cap蛋白双价纳米抗体的制备为PCV2的抗原检测和PCV2相关疾病的防控提供了新型候选抗体工具。

犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子的原核表达

为筛选犬新孢子虫保护性抗原,克隆表达犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(MIF)并对其免疫原性进行分析。根据GenBank公布的犬新孢子虫MIF(NcMIF)序列,利用分子生物学软件设计2套特异性引物,以NcMIF mRNA反转录产物为模版,采用PCR扩增出NcMIF基因和2种突变基因NcMIFm和NcMIFhis,选用原核表达载体pET26b,分别构建重组质粒pET26b-NcMIF和pET26b-NcMIFm。重组质粒分别转入E.coli BL21(DE3)中进行表达,纯化后的蛋白利用免疫印迹法进行鉴定。结果显示,rNcMIF和rNcMIFm这2种重组蛋白在BL21(DE3)表达菌株中均为可溶性表达,诱导表达最佳条件为30℃诱导3h IPTG诱导浓度为1mmol/L;Western blot分析结果表明,该表达产物能与抗rNcMIF绵羊血清发生反应,说明获得的蛋白具有较好的抗原性和特异性。

猪圆环病毒2型特异性纳米抗体文库的构建及鉴定

为构建猪圆环病毒2型(PCV2)特异性纳米抗体文库,并对其库容和多样性进行鉴定分析,使用PCV2全病毒灭活疫苗免疫羊驼,经四次免疫后采血分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,通过RT-PCR反转录合成cDNA;根据羊驼重链抗体基因序列设计特异性引物,通过巢式PCR扩增羊驼单域重链抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)基因片段vhh,并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,构建pCANTAB-vhh重组质粒;通过电穿孔法将重组质粒导入E. coli TG1获得抗PCV2特异性纳米抗体基因文库。文库菌梯度稀释后计数单克隆菌落数,并通过菌液PCR鉴定重组菌阳性率,计算抗体文库库容量;对PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,分析抗体文库多样性。结果显示,构建的PCV2特异性纳米抗体文库重组菌阳性率为92.0%,库容量为2.75×1010CFU/m L;测序后序列比对分析结果表明,纳米抗体文库包含的基因序列具有丰富的多样性。本研究成功构建了PCV2特异性纳米抗体文库,且文库质量满足后续试验要求,为进一步获得针对PCV2抗原的纳米抗体奠定了基础。

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性纳米抗体的原核表达研究

为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。

犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子生物学特性鉴定

为了对犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(NcMIF)生物学特性进行鉴定,将NcMIF在大肠埃希菌中以3种不同的形式进行表达,三种蛋白分别为NcMIF(成熟的蛋白质),NcMIFm(脯氨酸突变为甘氨酸)和NcMIFhis(在N端添加多组氨酸标记),对三种蛋白的多聚体状态、互变异构酶、氧化还原酶及是否与MIF受体(CD74)结合等进行分析。结果显示这三种重组的NcMIFs(rNcMIF)均不具备互变异构酶和氧化还原酶活性;甘氨酸替代脯氨酸的重组NcMIF减少了二聚体和三聚物的形成;N端额外添加的HIS标签增加了三聚物的形成;rNcMIF无法与重组人MIF竞争与MIF受体(CD74)结合,表明CD74不是NcMIF的结合受体;免疫荧光染色结果表明NcMIF定位于犬新孢子虫速殖子的顶端。免疫电镜结果进一步显示NcMIF存在于微线体、棒状体、致密颗粒及细胞核中。为进一步分析NcMIF在寄生虫免疫逃逸过程中的作用提供参考。

犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(NcMIF)克隆表达与其免疫调节作用鉴定

通过原核系统表达犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(NcMIF),并对该蛋白的免疫调节作用进行分析。根据Gen Bank发表的序列,利用分子生物学软件设计了一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增出NcMIF全基因,经测序分析后,将NcMIF亚克隆到原核表达载体p ET28a(+),然后将鉴定为阳性的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中用IPTG进行诱导表达。利用HPLC对可溶性表达的重组NcMIF蛋白进行纯化,去除内毒素,最后对NcMIF的免疫调节作用进行鉴定。结果显示,NcMIF没有明显的抗糖皮质激素的免疫抑制作用,也没有上调巨噬细胞TNF-α和NO表达量的作用,为进一步探究NcMIF的生物学功能及MIF在宿主免疫调节中的作用奠定了基础。