狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析

【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒试验中,重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M)攻毒后第4 d昆明小鼠开始出现精神不振、行动迟缓等症状,其致病性无明显差异;昆明小鼠体质量均呈一过性减轻,之后恢复正常并呈上升趋势;攻毒15 d内均未见昆明小鼠死亡,即重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRCHL(GX01P-M)的致病性较弱。【结论】强毒株GX01的P基因与M基因联合替换可提高病毒传播能力,且二者具有协同性,但对弱毒株rRC-HL的毒力无影响。

TaqMan荧光定量PCR检测滑液囊支原体方法的建立及其感染鸡血液内载量测定

【背景】滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是禽类的常见病原,严重危害家禽养殖业的发展。MS易与其他病原混合感染,给临床诊断造成困难,因此亟须建立一种快速、准确、灵敏的检测方法对疑似患病禽进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立一种检测MS的TaqMan荧光定量PCR方法,测定MS在感染鸡血液内的载量变化,为临床检测MS感染提供技术支持。【方法】参考GenBank中登录的MS基因保守区域序列设计特异性引物和探针,以温度梯度qPCR法确定最适退火温度,用矩阵法优化其引物和探针加入量,通过提取MS 0801基因组作为模板构建标准曲线,并进行特异性、灵敏度、重复性试验,建立一种检测MS的TaqMan荧光定量PCR方法。使用建立的方法检测滴鼻攻毒和足垫攻毒后MS在感染鸡血液内的载量变化。【结果】建立的TaqMan荧光定量PCR方法最佳退火温度为55℃,引物和探针(10 mol/L)加入量分别为0.8 mL和0.4 mL;扩增曲线具有良好的线性关系,R^(2)>0.99;特异性强,仅对MS有特异性反应,对其他病原均无扩增反应;敏感性高,最低检测限为25 copies/μL;重复性好,批间试验和批内试验变异系数均小于2%。通过TaqMan荧光定量PCR检测MS在感染鸡血液内的动态变化,发现两个攻毒组MS含量的峰值和总体波动无明显差异,但足垫攻毒的MS在血液中的增殖要快于滴鼻攻毒。【结论】本实验建立了一种能够快速检测MS的TaqMan荧光定量PCR方法,并用于检测MS在感染鸡血液内的动态变化,为临床上检测MS感染提供了技术支撑,为疫苗免疫评价方法提供了新的思路。