B型流感疫苗候选株在MDCK悬浮细胞上培养工艺优化研究

为了大规模生产重组B型流感疫苗候选株rIBV,本研究探索了rIBV在无血清MDCKs细胞上的最佳培养条件,再扩大到生物反应器中优化工艺参数,经过连续传代15代后测定了MDCKs细胞源毒种rIBV的遗传稳定性和病毒滴度。通过对病毒培养条件进行优化,我们确定了rIBV在MDCKs细胞上增殖的最佳培养条件是TOI为72h、MOI=0.001、CCI为4.0×10^(6)细胞、TPCK胰酶浓度为2μg/m L、50%DO和pH=7.2±0.5。rIBV在MDCKs细胞上连续传代15代后仍然具有高度遗传稳定性。相比于鸡胚源rIBV株,适应MDCKs细胞生长15代后rIBV株的EID_(50)由10^(6.25)/mL提高至10^(9.5)/mL,TCID_(50)由10^(4.5)/mL提高至10^(8.25)/mL。本研究对重组B型流感疫苗候选株r IBV在MDCKs细胞上的培养工艺进行了优化,获得一株具有高感染力和高病毒滴度的MDCKs细胞源疫苗候选株r IBV,为下游流感疫苗生产及纯化工艺奠定了基础。

H1N1嵌合冷适应疫苗株的构建及其生物学特性分析与鉴定

目的应用反向遗传技术构建以B型流感病毒冷适应株为骨架表达季节性流感病毒H1N1 HA蛋白的嵌合疫苗株。方法将B型流感病毒冷适应株B/Vienna/1/99的HA片段胞外区替换为H1N1(A/Victoria/2570/2019)的HA蛋白,将重组质粒与骨架株的其余7个质粒共转染293T细胞,拯救H1N1嵌合疫苗株。对重组病毒株进行血凝鉴定、RT-PCR鉴定、电镜鉴定、一步生长曲线绘制以及小鼠安全性评价。结果成功拯救出H1N1嵌合流感病毒株,命名为rA/B-H1-Vic。经测序鉴定其序列与预期一致,并且在电镜下观察到流感病毒粒子的典型特征。H1N1嵌合流感病毒株血凝效价最高达2^(5),在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(4.5) TCID_(50)/mL,在鸡胚中的病毒滴度为10^(8.36)EID_(50)/mL。分别以10^(6) EID_(50)和10^(5) EID_(50)剂量鼻腔接种小鼠,其体重与对照组相比无明显下降,小鼠存活率100%,攻毒后第3 d仅在小鼠鼻甲骨和肺脏组织检测到低水平的病毒复制。结论成功拯救出无毒力的H1N1嵌合疫苗株,为流感病毒新型疫苗的研制提供了新的思路。