小麦和玉米籽粒赤霉菌产毒类型的PCR检测

为了建立一种准确、快速鉴定赤霉菌毒素的方法,根据赤霉菌毒素生物合成调控路径T ri5-T ri6基因保守序列,设计了一对通用引物,用于检测和鉴别产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(N IV)毒素的赤霉菌特异DNA片断。结果表明,产生毒素DON的赤霉菌具有一个300 bp的特异DNA片断,而产生毒素N IV的则为360 bp。PCR检测与HPLC或GC/M S化学分析结果完全一致。利用这一方法分析检测了小麦、玉米籽粒中赤霉菌产毒类型,发现除健康籽粒外,在所有轻微、中度、严重感染赤霉病的小麦或玉米籽粒中,均同时检测到DON及N IV的两种DNA片断,表明这一对通用引物对两种毒素特异DNA片断的扩增效率相同。这些结果说明,该技术是一种经济、快速、可靠的PCR检测技术,可广泛用于赤霉菌及其毒素检测鉴定中。

镰刀菌毒素及其分子生物学研究进展

综述了近年来国内外关于小麦赤霉菌主要致病菌种禾谷镰刀菌毒素的形成与致病力的关系、毒素生 物检测及免疫化学检测方法、脱毒技术及毒素代谢途径的分子生物学研究的一些进展。

中国与欧洲禾谷镰刀菌DON毒素HPLC定量比较分析

选用4个来自中国、7个来自欧洲的代表性禾谷镰刀菌菌株，经脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）毒素特异引物鉴定，确认其具有产生DON毒素的遗传物质基础后，接种于PDB培养基培养7d，从培养基上清中经硅胶柱分离、纯化DON毒素，经HPLC定量分析表明，纯化的禾谷镰刀菌DON毒素，与购自公司的DON毒素标准样品一样，其HPLC检测谱峰清晰明显，基线平稳，无干扰，保留时间为9．5min左右；供试菌株的DON毒素含量分布在0．023～1．934μg／mL之间，德国菌株F703产毒量最大，比位居第二的中国菌株5005（1．232μg／mL）高57％；其余的6个欧洲菌株中，除意大利菌株Lor9（0．128μg／mL）略低于另一个中国菌株7105（0．135μg／mL）外，均比3个中国菌株（4020、7105、8029）的产毒量大．欧洲镰刀菌产生DON毒素的能力远远大于中国菌株，这说明欧洲菌株长期在欧洲生态环境下已演变形成其特有的高毒素代谢类型，我国有必要严防欧洲禾谷镰刀菌入侵，加强对来自欧洲的禾谷类粮食及其产品的镰刀菌和毒素的检疫和监控；同时，本研究建立的毒素样品制备与HPLC检测体系可用于准确定量分析样品的DON毒素．

禾谷镰刀菌培养性状与致病力的相关性分析

选择来自我国12省市有代表性的101株禾谷镰刀菌菌株,比较它们在PDA培养基上的表型性状以及在CMS液中的产孢量;并于田间小麦开花期,用单花剪滴法接种3个抗赤霉病性不同的小麦品种,鉴定其致病力,用SAS软件进行统计分析。结果表明,菌落扩展速度不同的菌株间,其致病力差异显著;相关分析证实, 菌落扩展速度与致病力之间呈极显著线性正相关(P=0.000 3),菌丝生长状况与致病力之间呈极显著非线性相关(P=0.008 3),而基质颜色和产孢量与致病力没有相关性。这些结果说明,禾谷镰刀菌菌落的扩展速度及菌丝生长状况与致病力之间具有共同的遗传基础或遗传相关性。

基质固相分散-液相色谱串联质谱法 同时检测鸡蛋中15种真菌毒素生物标志物

采用基质固相分散（ Matrix solid phase dispersion, MSPD）技术,结合高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱联用技术（ HPLC-ESI-MS/MS）分析,在多反应监测（ MRM）模式下建立了鸡蛋中呕吐毒素、黄曲霉素、玉米赤霉烯酮等15种真菌毒素生物标志物的同时定量分析的方法。样品与吸附剂C18颗粒直接混合装柱,并用20 mL 1 mmol/L甲酸铵的乙腈/甲醇（1：1, V/V）溶液洗脱、吹干,萃取液经复溶、过滤后即可进行检测,整个分析过程无需复杂的净化、离心等步骤。本方法在0.2-100 ng/mL范围内具有良好的线性关系,相关系数R2逸0.9931,检出限在0.05-2.0μg/kg 之间,定量限在0.2-4.0μg/kg 之间,样品的提取回收率为61%-90%。

南阳市玉米穗腐病致病镰刀菌种群结构分析

镰刀菌是玉米穗腐病的主要病原菌.本研究对南阳市5县2009年夏玉米穗腐病致病镰刀菌的种群结构进行调查分析.从病样中按常规组织分离法进行病原菌分离,对分离物经单孢分离纯化后根据柯赫法则进行致病性检测,并根据形态特征和核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS)序列对病原菌进行鉴定.从采集的80份穗腐病样品中分离获得105株镰刀菌,接种结果表明,所有菌株对玉米均有致病性.形态和分子鉴定结果表明,引起南阳市玉米穗腐病的镰刀菌至少有4种:层出镰刀菌Fusarium proliferatum、串珠赤霉菌Gibberella monoliformis、木贼镰刀菌F.equiseti及玉蜀黍赤霉菌G.zeae.南阳市玉米穗腐病致病镰刀菌以层出镰刀菌为优势种,串珠赤霉菌为次优势种.

玉米赤霉烯酮快速间接竞争酶联免疫检测技术研究及应用

在获得高特异性单克隆抗体的基础上,通过间接竞争酶联免疫检测技术建立了一种在室温下(25℃)快速、定量检测玉米赤霉烯酮的方法。该方法前处理简单,检测时间仅30 min,检出限为0.3μg/kg,线性范围0.5-10μg/kg,回收率为76.7%-104.2%。应用此方法测定了16份小麦、玉米等谷物样品中玉米赤霉烯酮的含量,其中小麦9份、玉米7份,检出率为69%,含量在5.12-400.02μg/kg,其中2份样品为阳性。同时该ELISA检测结果与LC-MS/MS的验证结果无显著性差异。因此,该新型快速、定量的ELISA技术对小麦、玉米样品中玉米赤霉烯酮的大范围筛查具有一定的应用价值。

量子点荧光免疫法快速测定氧氟沙星

研究建立了基于量子点(quantum dots,QDs)的间接荧光免疫吸附测定技术(competitive fluorescence linked immunosorbentassay,cFLISA),并应用于牛奶中的氧氟沙星(ofloxacin,0FL)抗生素残留检测中。首先将量子点同抗氧氟沙星抗体通过生物素-亲和素系统进行连接,优化连接条件进行并测定连接效率。其次对cFLISA测定条件进行了优化,并确定了合适的检测时间≤60min。所建立方法的最低检测限(IC_(90)值)和IC_(50)值分别为0.25 ng·mL^(-1)和1.16 ng·mL^(-1)。cFLISA针对实际牛奶样品中氧氟沙星抗生素残留回收率测定结果为88.2%～105.3%,CV值为7.3%～10.9%,同传统酶联免疫吸附测定(ELLSA)方法相比十分接近。结果表明,本研究所建立的cFLISA方法可以替代传统的ELISA方法应用于牛奶中氧氟沙星抗生素残留的实际测定中。更重要的是,新方法对于针对不同药物残留的多重测定技术的建立具有一定的参考价值。

采用同位素稀释高效液相色谱-串联质谱法同时测定银杏叶中5种黄曲霉毒素的研究

建立了一种能够同时测定银杏叶中5种黄曲霉毒素(黄曲霉毒素B_1、黄曲霉毒素B_2、黄曲霉毒素G_1、黄曲霉毒素G_2及黄曲霉毒素M_1)的高效液相色谱-串联质谱定量分析方法。检测结果表明:5种黄曲霉毒素的检测限及定量限范围分别为0.15~0.80μg/kg和0.50~1.50μg/kg;线性范围在0.5~100.0 ng/mL时,R^2≥0.9990;高、中、低加标回收率分别为85.98%~95.21%、88.92%~98.15%和75.34%~87.09%,相对标准偏差≤13.55%。该方法具有检测速度快、灵敏度及回收率高等优点,能用于同时测定银杏叶中5种黄曲霉毒素的含量。

K88 ad ETEC菌毛蛋白亚基基因faeC的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为研究毒素源性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白分子装配机理,从K88adETEC中PCR扩增出K88菌毛蛋白小亚基基因片段faeC,然后将其克隆到大肠杆菌表达载体pET30a(+)中,获得重组质粒pET30C,并将该质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中;重组菌株经IPTG诱导后,经过SDS PAGE分析表明该菌株可以表达FaeC蛋白(16.9kDa),且重组蛋白主要以包涵体形式存在,约占菌体蛋白的30%。用分离纯化的重组FaeC蛋白免疫小鼠,获得FaeC的鼠抗血清,经免疫学分析表明,利用此重组蛋白制备的抗血清与FaeC重组蛋白及K88adETEC的菌毛蛋白都能发生特异性抗原抗体反应。

真菌毒素快速检测技术研究进展

真菌毒素污染是造成食品安全问题的重要因素之一,是目前和将来很长一段时间内全球食品安全领域研究的热点与焦点之一。真菌毒素是真菌在生长过程产生的次生代谢产物,其污染范围广泛,尤其易污染谷物类等粮食作物。由于其具有致畸、致癌、致突变等特性,易延伸至食物链,对人和动物健康带来严重危险。因此为了降低和控制其危害,首先需要严格检测监测真菌毒素的污染水平,开发高效、快捷的检测方法与配套产品。相对于色谱及其与质谱联用等具有检测结果准确,前处理复杂,检测成本高,不适于现场、高通量检测等常规实验室分析方法,快速检测具有现场、快速、低成本等优势,已成为实际真菌毒素监控中应用最广泛的方法。本文综述了国内外近三年内真菌毒素快速检测领域的最新研究进展,以期为我国食品安全中真菌毒素污染的有效监管提供技术参考。

利血平分子印迹聚合物在饲料检测中的应用

以获得的利血平(Reserpine,RES)分子印迹聚合物为填料,制备出分子印迹固相萃取小柱,对饲料中的利血平进行富集、纯化;结合高效液相色谱法,建立了基于分子印迹技术的检测饲料中利血平的新方法,灵敏度达0.05μg/g,回收率达80%以上,可应用于实际检测。

温度和pH对不同镰刀菌生长及产毒的影响

以从小麦、玉米、大米、大麦等作物中分离得到的12株不同种类的镰刀菌菌株为研究对象,探究不同温度和p H对其生长及产毒的影响。结果表明,镰刀菌在10~35℃和p H3~11范围内均能够生长,最适温度为20~30℃,最适p H为6~8。供试镰刀菌能够产生的毒素主要为A型单端孢霉烯族毒素、B型单端孢霉烯族毒素、伏马毒素和镰刀菌酸,产毒温度为5~40℃,但不同菌株的最适产毒温度存在差异;产毒过程受p H影响较大,过酸（p H3~5）及过碱（p H9~11）的条件下均未检测到任何毒素。总体上看,不同种类镰刀菌产毒类型存在差异,毒素产量受温度和p H影响比生长更大,且大多数菌株的生长与产毒最适条件并不一致。

室温下麦粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及其隐蔽型(D3G)毒素累积分析

为了研究麦粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及其隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(D3G)的累积情况,将禾谷镰刀菌菌株F-1和5035分别人工接种至经高温灭菌、8 k Gy和15 k Gy辐照的麦粒中25℃培养7、14、21、28、35 d后,通过LC-MS/MS方法测定DON和D3G毒素在麦粒中的含量。不同处理的麦粒中DON含量均随培养时间延长逐渐增加;禾谷镰刀菌接种灭菌麦粒及15 k Gy辐照麦粒均未检出D3G毒素;禾谷镰刀菌接种8 k Gy辐照小麦籽粒后检测到隐蔽型毒素D3G,培养7 d时D3G最高且其含量随着培养时间延长逐渐降低;本文使用指数模型拟合25℃下F-1与5035接种麦粒(8 k Gy辐照)中D3G/DON的比值与时间关系的R2分别为0.97、0.93,R2均在0.9以上,说明指数模型能够较好地拟合本实验条件下时间与D3G/DON的比值的变化,为进一步后续研究提供依据。

香菇中污染真菌的分离与鉴定

从上海及周边地区的香菇子实体和培养料中分离污染真菌,并进行形态学观察和分子生物学鉴定。提取菌株基因组DNA,利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增菌株rDNA ITS区序列,测序后在数据库中进行比对分析,并利用软件:MEGA5构建菌株分子系统发育树。结果表明:香菇栽培到储藏过程中主要污染真菌有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、附球菌属(Epicoccum)、镰孢属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)和节菱孢属(Arthrinium)等。

基于电化学法的农药污染检测专用软件设计

为实现农药污染定量检测,通过酶水解底物发生电化学反应产生电子,用电信号减弱的比率量化酶活性被农药抑制的程度,利用抑制率与农药浓度之间的量化关系来估计农药浓度。根据这一方法设计农药污染检测专用软件,控制电化学工作站提取酶电极传感器信号,测量原始酶和被样品抑制的酶水解底物产生的电流信号大小并计算抑制率,最后搜索、比对数据库并显示样品的农药污染检测结果。利用敌敌畏与克百威两种农药配置不同浓度的样品进行实验,在检测结果判定的主要浓度范围时,专用软件的测量误差在10%以内,以抑制率大于50%作为样品呈阳性的条件,单次检测的假阴性概率小于11.1%。

食品及其生产环境和包装材料中分离霉菌的形态与分子鉴定

为了明确食品及食品包装材料、食品的生产坏境中污染霉菌菌株种类,本文对收集、单孢分离的55株霉菌菌株同时采用形态学和分子生物学方法鉴定,并相互验证。实验结果表明:55株污染霉菌主要包括有曲霉属(Aspergillus sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、青霉属(Penic illiumsp.)、枝孢菌属(Cladosporium sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)等,这为食品中霉菌污染的安全控制和菌株溯源提供了有价值的参考信息。

果蔬中常见真菌毒素的检测研究进展

果蔬在田间的生长过程以及采摘后的贮存、运输和加工过程中,容易受到病原真菌的污染,病原菌通过寄主果蔬表面伤口或自然孔口侵入,导致果蔬腐烂并积累大量真菌毒素。腐烂果蔬会造成巨大的经济损失,同时经由食物链的传递威胁人和动物的健康。鉴于果蔬中真菌毒素的危害性,本文总结了近年来主要污染果蔬的毒素的种类、污染现状、危害及其检测方法,其中目前检测仍以色谱法、质谱法等仪器检测为主,虽然可以精确定量检测,但是耗材和时间成本较大;随着大规模样本的筛选检测需求的提高,免疫法和表面增强拉曼光谱法等高通量的快速检测逐渐受到关注。本文旨在为真菌毒素的检测防控提供参考。