变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因功能丧失菌株的构建

目的:构建变形链球菌UA159磷酸蔗糖变位酶基因(phospho-sugar mutasegene,psm)功能丧失菌株,为进一步研究变形链球菌psm功能做准备。方法:将变形链球菌UA159 psm内部上、下游2段序列分别克隆至自杀质粒pFW5的2个多克隆位点(MCS-I和MCS-II),构建重组质粒,并经酶切和测序证实。利用同源重组(homologous recombination)原理,采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和变形链球菌UA159同源序列的等位交换(allelic exchange)。结果:经过PCR和测序分析,证实变形链球菌UA159基因组中的psm被重组质粒的基因(含有壮观霉素抗性)取代。结论:成功构建了变形链球菌UA159psm功能丧失菌株。

构建变形链球菌psm基因同源重组质粒的实验

背景:为了深入研究磷酸蔗糖变位酶基因psm与变形链球菌S.mutans致龋性之间的关系,需要利用同源重组原理构建psm基因功能丧失菌株,因此构建一个符合同源重组条件的合格质粒载体就成为实验工作的重要前提。目的:构建变形链球菌S.mutans UA159psm的两种同源重组质粒。设计、时间及地点:于2005-12/2006-07在北京大学医学部病原微生物实验室完成的单一样本观察实验。材料:实验所用口腔链球菌均来自四川大学华西口腔医学院微生物实验室。方法:首先应用Southern Blot对psm基因的保守性进行分析,再将S.mutans UA159psm基因内部序列分别克隆至自杀质粒pSF151和pVA981上的多克隆位点,构建重组质粒。主要观察指标:psm基因的保守性及重组质粒pSF151及pVA981的构建结果。结果:psm基因在实验中所列8种S.mutans中保守存在;经过聚合酶链反应和酶切分析,两个重组质粒所插入片断无误。重组质粒pSF151(空质粒大小为3.5kbp)和pVA981(空质粒大小为7.1kbp)构建成功。结论:两种可以用于转化S.mutans UA159的重组质粒的构建可用于今后S.mutans UA159psm基因功能的研究,且重组质粒大小是否影响转化效率需后续观察。

豚鼠铜绿假单胞菌生物膜肺感染模型的建立

目的建立豚鼠铜绿假单胞菌生物膜肺感染模型。方法 40只Hartley品系雄性豚鼠随机分为模型组和对照组,经气管注射含琼脂微颗粒的铜绿假单胞菌生物膜(模型组),或生理盐水(对照组)。第30天取肺和支气管组织,观察组织形态变化以及生物膜形成,从肺和支气管肺泡灌洗液(BALF)内分离细菌并测定其生物膜形成能力。结果模型组豚鼠肺泡壁萎缩,肺组织实变,炎症细胞聚集,脓肿形成,肺泡间隔炎症细胞浸润,肺不张;支气管纤毛上皮脱落,黏膜下淋巴细胞浸润,部分支气管管腔内炎症渗出。支气管以及肺泡内壁有细菌生物膜生长。左肺和BALF内分离的铜绿假单胞菌生物膜形成能力无差异(P=0.82)。结论豚鼠气管内注射含琼脂微颗粒的铜绿假单胞菌生物膜可建立可靠的生物膜肺感染模型,该模型适用于探讨细菌生物膜感染与宿主免疫系统之间的相互作用。

变形链球菌thrS基因生物信息学分析及同源重组质粒的构建

背景:变形链球菌是公认的主要致龋菌,细菌的黏附、生物膜形成、产酸、耐酸等各个表型都与细菌的致龋性相关。有研究结果提示,苏氨酰-tRNA合成酶基因(threonyl-tRNA synthetase,thrS)可能与变形链球菌的黏附、产酸、耐酸等致龋性表型相关。目的:对苏氨酰-tRNA合成酶基因进行保守性分析,构建用于变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因敲除的重组质粒。方法:首先通过生物信息学结合SouthernBlot对苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性进行分析,再将变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因上下游序列分别克隆至自杀质粒pFW5上的多克隆位点,构建用于基因敲除的重组质粒。观察苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性及重组质粒的构建结果。结果与结论:苏氨酰-tRNA合成酶基因在实验中所列6种变形链球菌中保守存在;经过聚合酶链反应和酶切分析,重组质粒所插入片断无误。表明重组质粒pFW5-thrS构建成功。重组质粒pFW5-thrS的构建可用于今后变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因功能的研究。

基于AHP和熵的改进价值工程法在边坡防护方案优选中的应用

基于层次分析法(AHP)和熵的改进价值工程法,即用AHP确定功能的权重,用熵的技术对功能进行排序得出各方案的功能指数,结合垄茶(界化垄—茶陵)高速公路K0+720—860左侧顺层岩质边坡防护,对顺层岩质边坡防护方案进行比较评价,以克服传统价值工程方法中功能权重计算的模糊性和功能评分的主观性。

上颌第一前磨牙根管峡部的发生率及临床意义

目的研究离体上颌第一前磨牙单根牙根尖1mm～6mm区域根管峡部的发生率和位置的情况。方法收集离体单根上颌第一前磨牙50颗,自根尖开始,片切去除1mm牙根后,用美蓝染色根切面,在显微镜下观察并记录各横截面的根管峡部的类型。在距根尖2、3、4、5、6mm处分别重复以上操作。结果单根的上颌第一前磨牙双根管率是54.00%;根管峡部发生率在距根尖4mm～6mm区较高。结论上颌第一前磨牙的根管峡部发生率在距根尖4mm水平最高。使用手术显微镜可提高对根管峡部的辨认和处理能力。

丙型肝炎病毒F蛋白诱导LX2肝星形细胞活化

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白对肝星形细胞(HSC)功能的影响。方法采用脂质体转染法将pcDNA3.1-f(实验组)或pcDNA3.1空质粒(对照组)转染HSC株LX2细胞,24、48 h后收集细胞,用Western blot法检测α-肌动蛋白(α-SMA)含量,RT-PCR法测定金属蛋白酶组织抑制因子1(TI MP-1)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因mRNA表达水平。结果转染后24、48 h,实验组LX2细胞α-SMA蛋白表达量以及TI MP-1基因mRNA水平均明显高于对照组,两组细胞MMP-2基因mRNA水平接近。结论 HCV F蛋白能够活化HSC,上调其TI MP-1基因转录水平,但不影响MMP-2基因转录水平,使MMP-2蛋白的有效酶活性下降,造成肝组织细胞外基质(ECM)降解速率减慢,进而发生纤维化。

用于防排水预制构件的聚丙烯纤维混凝土性能试验研究

通过掺入聚丙烯纤维以提高用于公路边坡用混凝土预制构件的抗裂性能,研究了聚丙烯纤维掺量对混凝土工作性、抗压强度、抗冲击性、抗冻性等性能的影响。研究结果表明:聚丙烯纤维的掺入使得混凝土坍落度降低,但粘聚性及保水性增强。与普通混凝土相比,掺入聚丙烯纤维可提高混凝土的抗压强度及抗冲击性能。当掺量为1.5 kg/m3时,混凝土90 d抗压强度提高了21.1%,破坏冲击耗能比素混凝土增加了273.3%。随聚丙烯纤维掺量的增加,混凝土的抗冻性能也呈上升趋势,当纤维掺量为1.2 kg/m3时,强度损失率达到最低。

红砂岩顺层岩质边坡开挖变形特性分析

红砂岩顺层岩体边坡由于胶结物质和风化程度的差异,其强度的变化较大,在开挖卸载、自重应力、爆破震动等作用下,极易发生变形破坏,影响边坡的施工进度。因此研究红砂岩顺层岩质边坡开挖变形特性十分有必要。以垄茶高速公路典型路堑边坡为依托,分析了红砂岩的物理力学性质,采用ADINA有限元软件计算开挖变形位移,将计算结果与开挖变形监测结果进行对比分析,所得计算位移量与实测位移量基本一致,验证了用ADINA中的Mohr-Coulomb材料模型计算红砂岩顺倾岩质边坡开挖变形位移的可靠性。

顺倾岩质高边坡开挖变形机理及计算

为了进一步分析顺倾岩质高边坡开挖变形机理及变形计算方法,以卸荷岩体力学及弹性力学理论为基础,对顺层岩质边坡开挖前后边坡岩体的力学状态进行了分析,对边坡变形机理及变形计算方法进行了研究.研究结果表明,顺倾岩质边坡在开挖过程中岩体受力状态发生改变,岩体力学参数劣化,造成边坡发生较大变形;顺层岩质边坡变形主要由浅表松弛变形、卸荷回弹变形及顺层滑移变形组成.并以弹性力学为基础提出了边坡卸荷回弹变形的计算方法,依据能量守恒定律推导了顺层滑移变形的计算方法.

聚丙烯纤维对砌筑砂浆性能的影响研究

砌筑砂浆中添加高聚物纤维后可显著改善各项使用性能。通过在砂浆中掺入不同剂量的聚丙烯纤维,进行稠度、抗压强度、抗折强度、干缩量等性能试验,试验结果与素砂浆对比分析表明:聚丙烯纤维能有效提升砂浆的稠度、提高砂浆的抗折强度、减少砂浆的干缩量,但砂浆抗压强度随聚丙烯纤维掺量的增加呈先降后升的趋势,当聚丙烯纤维掺量达到一定剂量后砂浆抗压强度超过素砂浆。

平接缝预制块拱形骨架护坡应力位移监测研究

依托垄茶高速公路工程边坡拱形骨架护坡试验段,对平接缝预制块拱形骨架护坡结构进行现场应力与位移监测,并与其数值模型分析结果进行比对,探讨平接缝预制块拱形骨架护坡结构的受力机理。现场试验段监测数据分析结果表明,平接缝预制块拱形骨架护坡结构随使用时间的增加:各监测点的应力、位移持续增加,直至趋于稳定;不同点位应力、位移变化规律基本一致。现场试验段监测数据与数值分析结果共同表明:平接缝预制块拱形骨架护坡结构各拱圈的拱脚处为受力不利点位;上排拱圈上点的应力小于下排拱圈上对应点应力;上排拱圈上点的位移大于下排拱圈上对应点的位移;在同一拱柱坡线上,点位竖向位移与离坡顶斜距呈非线性减少,坡顶竖向位移最大。

不同植被恢复方法对垄茶高速公路边坡土壤矿质元素含量的影响

为明确不同植被恢复方法对边坡土壤中矿质营养、p H值和有机质含量的影响,在边坡恢复一年后对不同样地土壤中的养分元素、p H有机质含量等进行了测定。结果表明:种植细叶美女樱、红叶石楠、杜鹃等样地的土壤中氮元素增加最多,含量是新土的8.6倍。椰网防护加喷播的土壤中磷含量最高,是新土的8.3倍,喷播灌木丛马棘的磷含量则是新土的7.7倍。椰网防护加喷播处理钾含量是新土钾含量的6.5倍。喷播灌木丛马棘样地中镁含量最高,是新土的4.6倍。除了紫穗槐样地外所有样地p H值均小于7。相对于新土和煤矸石,所有处理样地中的各种有机质均有较大提高,但远低于自然群落中的含量。椰网防护样地的有机质含量最高,是新土的11.0倍;喷播灌木丛马棘的样地、喷播形成的草坡样地等样地也较高;增加最少的是种植佛甲草样地,是新土的4.0倍。结果表明,椰网防护加上喷播技术能在较短时间内增加土壤中的矿物质和有机质的含量,有利于植物生长。

改良第八代粘接剂对龋影响牙本质粘接性能的影响

目的:第八代粘接剂Single Bond Universal(SBU)是最新一代的粘接剂,表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)是基质金属蛋白酶抑制剂及偶联剂,本研究探讨添加EGCG是否可以提高SBU粘接强度及降低微渗漏。方法:将人中龋离体牙去除冠部釉质,龋指示剂下制备龋影响牙本质。将离体牙随机分组(对照组,EGCG 100μg/ml组,EGCG 200μg/ml组,EGCG 300μg/ml组),使用SBU进行粘接,上方堆砌树脂,在流动水下,使用慢速线性切割机进行切割,制备微拉伸试件及微渗漏试件。微拉伸仪检测粘接强度,场发射扫描电镜观察断裂后界面显微结构,激光共聚焦显微镜检测试件微渗漏。结果:添加EGCG能明显提高SBU对龋影响牙本质的粘接强度(P<0.0001, F=17.11),微渗漏显著减少。结论:EGCG能改良SBU对龋影响牙本质的粘接性能。

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立

目的探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价。方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculo-sis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR(FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV)。结果靶向Mtb 16SrDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA)1.2 pg/μL,即(38.9±3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27%和1.26%。结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测。

靶向CDC42基因小干扰RNA分子的制备

目的制备靶向CDC42基因的小干扰RNA分子(siRNA)并检测其对CDC42基因表达的抑制效果。方法针对CDC42基因的不同区域设计4条siRNA分子,体外转录法合成siRNA分子,将siRNA与CDC42基因真核表达载体共转染HEK293T细胞,Westernblot法测定CDC42蛋白含量。结果合成了siR1、siR2、siR3、siR4共4条siRNA分子,siR3对CDC42基因表达的抑制率为95%,siR1、siR2以及siR4对CDC42基因表达的抑制作用不明显。siR3对HEK293T细胞生长无明显影响。结论体外转录法制备的siR3分子能够高效特异地抑制CDC42基因表达。

一种口腔印模专用消毒剂对乙肝病毒活性及免疫原性的影响

目的观察以一种主要成分为苄索氯铵和异丙醇的口腔印模专用消毒剂对口腔印模表面乙肝病毒活性及免疫原性的影响。方法使用消毒液对HBV污染的口腔印模进行喷雾消毒,检测HBs Ag含量和HBV-DNA含量,评价消毒效果;检测消毒前后HBV在体外诱导淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2含量,评价对HBV免疫能力的影响。结果喷雾消毒3 min和15 min,对HBs Ag和HBV-DNA的灭活效果明显高于消毒1 min组,灭活率分别为(98.8±1.2)%、(98.9±1.1)%和(99.3±1.1)%、(99.4±1.3)%。消毒3 min和15 min HBV诱导淋巴细胞IFN-γ相对表达量明显高于空白对照和未消毒组;与空白细胞组比较,未消毒组HBV诱导淋巴细胞IL-2相对表达量明显增加,而各消毒组的IL-2相对表达量未发生显著变化。结论该消毒剂喷涂口腔印模时,对HBV的最佳消毒时间为3 min。此时HBV仍然保持较强的免疫原性,能够诱导淋巴细胞IFN-γ表达水平上调,对IL-2表达水平无影响。

丙型肝炎病毒F蛋白上调肝星形细胞胶原表达

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)的F蛋白对肝星形细胞生长及胶原蛋白表达的影响。方法将含有HCV f基因的pcDNA3.1-f质粒或pcDNA3.1空载体分别转染肝星形细胞株LX2,G418筛选后获得稳定转染的细胞,分别命名为LX-f细胞或LX-p细胞,MTT法测定细胞增殖情况,ELISA法检测细胞分泌的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量。结果自培养24 h起,LX-f细胞各时间点的增殖率均大于LX-p细胞(P<0.01)。培养48 h时,LX-f细胞的Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白分泌量分别为(25.89±0.42)ng/ml和(18.21±0.49)ng/ml,明显高于LX-p细胞的(22.65±0.49)ng/ml和(15.29±0.62)ng/ml(P<0.01)。结论 HCV的F蛋白能促进肝星形细胞增殖,并上调细胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白,诱发肝纤维化。