cdt基因亚基cdtA的克隆及其原核表达载体的构建

目的:进行伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)cdtA基因的克隆并构建其原核表达载体,为进一步研究CdtA蛋白功能以及CDT全毒素的功能做准备。方法:从AaATCC29522中通过PCR获得cdtA基因片段,克隆到中间载体pMD19-TVector中,再经双酶切得到cdtA片段克隆到原核表达载体pET-15b中,得到融合表达载体pET-15b-cdtA。结果:成功构建pET-15b-cdtA,经PCR鉴定以及测序鉴定插入cdtA基因序列正确,阅读框架完整,未发现突变。结论:成功克隆了cdtA基因,并在原核载体上得以表达。

伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素研究进展

细胞致死性扩张毒素(cytolethal distending toxin,CDT)是近年来新发现的一种伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)的毒力因子(Aa CDT),研究发现该毒力因子在Aa的牙周致病机制中发挥着重要的作用。本文就Aa CDT的结构和功能、作用机制及致病机制等方面的研究进展作一综述,以期进一步了解Aa的致病机理。

伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素的细胞毒性研究

目的:体外诱导表达伴放线放线杆菌(Aqqregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)细胞致死性扩张毒素(cytolethal distending toxin,CDT),观察其对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和人宫颈癌上皮细胞(HeLa cell)的毒性作用。方法:诱导重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC的体外表达,采用镍亲和层析柱法纯化目的蛋白,体外重构Aa CDT全毒素。通过体外酶活性实验检测重组蛋白CdtB的生物学活性,并通过细胞克隆形成实验(Colony-forming experiment)及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe nyltetrazolium bromide,MTT]比色法进一步观察CDT对CHO细胞和HeLa细胞的毒性作用。结果:由重组蛋白Aa CdtA、CdtB、CdtC体外重构获得的Aa CDT全毒素不仅抑制CHO细胞增殖,导致CHO细胞克隆形成单位(Colony-Forming Unit,CFU)数目减少甚至消失。也可抑制He-La细胞增殖并引起包括细胞体积增大及细胞核增大增多的细胞形态学改变,并且此增殖抑制作用呈浓度依赖性。结论:体外成功构建了具有生物学活性的Aa CDT全毒素,且Aa CDT毒性发挥需要三个亚基CdtA、CdtB、CdtC同时存在并构成三聚体。

氟保护漆联合窝沟封闭对第一恒磨牙防龋的效果评估

目的评估氟保护漆联合窝沟封闭对第一恒磨牙防龋的效果。方法选择6~8岁的儿童300名,共纳入1 200颗牙齿采取自身对照方法实施窝沟封闭、窝沟封闭联合氟保护漆,于6、12、18、24个月观察并分析两组窝沟封闭保留率及龋病发病率情况。结果各个时间段试验组较对照组具有更高的窝沟封闭保留率、更低的龋病发病率,经统计学分析,12个月、18个月的龋病发病率两组之间具有统计学意义(P<0.05),2年后试验组与对照组相比龋降低率为61.3%。结论本研究提示在窝沟封闭的基础上联合氟保护漆较单纯窝沟封闭具有更好的龋病预防效果。

不同镍钛旋转器械平解剖性根尖孔长度预备根管后根尖孔表面形态变化的研究

目的:研究不同镍钛旋转器械在平解剖性根尖孔长度时预备根管后根尖孔表面形态的变化。方法:选取因牙周病拔除的离体牙40颗,随机分为两组并在扫描电子显微镜下拍摄术前片,记录根尖孔表面形态;分别采用K3锉、TF锉在工作长度下(平解剖性根尖孔长度)预备根管,扫描电子显微镜下观察并记录预备后根尖孔表面形态的变化:记录根尖孔的偏移、根尖孔周围牙骨质缺损及根尖孔周围表面的裂纹。结果:K3组、TF组根管预备后均存在根尖孔的偏移、牙骨质的缺损及根尖孔周围表面的裂纹,其中根尖孔的偏移的样本数目、根尖孔周围牙骨质缺损样本数目两组之间存在统计学差异(P<0.05),根尖孔周围表面裂纹样本数两组之间无统计学差异。结论:K3、TF两种镍钛旋转器械在平解剖性根尖孔长度下预备根管时由于超根尖止点预备,均可导致根尖孔偏移,根尖孔周围的牙骨质缺损及根尖孔表面裂纹线产生,与K3锉相比,TF锉在减少根尖孔偏移及根尖孔周围牙骨质缺损方面更具优越性。

伴放线放线杆菌cdtB基因克隆及其表达蛋白的体外生物学活性检测

目的 体外构建伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa）CdtB蛋白的原核表达载体并诱导其表达,通过变性、复性获得有Ⅰ型脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease Ⅰ,DNase Ⅰ）样活性的重组CdtB蛋白,为进一步研究AaCdtB的功能以及Aa细胞致死性扩张毒素三聚体全毒素在牙周炎发生、发展过程中的分子致病机制奠定基础.方法 以AaATCC29522基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应（PCR）法获得cdtB基因,经双酶切、连接的定向克隆技术构建原核表达载体pET-15b-cdtB.转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导CdtB蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）及蛋白质印迹法检测并鉴定蛋白表达.纯化的重组CdtB体外与超螺旋质粒（pET-32a）DNA孵育,观察其生物学活性.结果 经测序鉴定,构建的原核表达载体pET-15b-cdtB转染的感受态大肠杆菌携带有cdtB基因,该基因片段与GenBank中已收录的AacdtB基因序列一致性高达99%.SDS-PAGE观察到32 000左右的高表达蛋白条带,蛋白质印迹法发现带有6个组氨酸蛋白标签标记的目的 蛋白CdtB.超螺旋质粒DNA与CdtB体外孵育后发生了解螺旋现象.结论 本项研究成功构建了AaCdtB的原核表达载体并诱导CdtB蛋白的体外表达,获得了具有DNaseⅠ样活性的重组CdtB蛋白.

氟保护漆在第一恒磨牙龋病预防中的效果评估

目的观察氟保护漆预防第一恒磨牙龋病的临床效果。方法选取600名6～8岁的儿童计2 400颗牙齿进入2部分试验,采取自身对照方法分别接受空白对照、氟保护漆;氟保护漆及窝沟封闭处理,于6、12、18、24个月观察并两两比较分析龋病发病率及2年各组患龋率情况。结果第一部分研究结果显示各个时间氟保护漆组比空白对照组具有更低的龋病发病率,经统计学分析,12、18、24个月的龋病发病率及2年的患龋率2组差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分结果显示:各个时间段氟保护漆组比窝沟封闭组均具有略高的龋病发病率,但2组龋病发病率及患龋率差异无统计学意义。结论氟保护漆有较好的龋病预防效果,可考虑在临床上推广应用。