全日制兽医专业学位研究生培养体系存在的问题与对策

兽医专业学位研究生教育是构建中国特色现代化兽医体系、适应重大社会需求的重要保障。结合我国兽医专业学位研究生教育的现状,从培养目标、师资队伍、培养过程以及人才培养质量等方面剖析了兽医专业学位研究生培养存在的主要问题。结合当前我国兽医专业学位教育体系改革的现状,从培养目标定位、优化培养过程、推进国际化等方面提出了一些对策,以期为推动我国兽医专业学位高质量、高水平、内涵式发展提供参考。

分组合作学习法在研究生《兽医微生物学研究进展》课程教学中的应用

《兽医微生物学研究进展》课程是兽医专业研究生的一门必修专业基础课。为进一步提高这门课程教学效果,将分组合作学习法引入该课程教学过程中,探索该教学方法对研究生的文献检索汇总、科研探索、分工合作等多项能力的影响。与传统的课堂讲授式教学方法相比,分组合作学习法显著地激发研究生参与专题学习的兴趣,提高研究生的科研素养和创新能力,极大提升《兽医微生物学研究进展》的教学效果。

1株猪源阴沟肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性研究

为研究猪源阴沟肠杆菌的生物学特征及药物敏感性,从临床病死猪病料中分离到1株优势细菌,经革兰染色、镜检、MALDI-TOF鉴定、16S rRNA序列分析,确定分离菌株为阴沟肠杆菌。对分离菌株进行小鼠感染试验,结果显示,分离的猪源阴沟肠杆菌对小鼠的半数致死量(LD_(50))为1.4×10~8 CFU。药物敏感性试验结果表明,分离的猪源阴沟肠杆菌对阿米卡星、大观霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素、多黏菌素B敏感;对头孢他啶、头孢曲松、氨苄西林、青霉素、氟苯尼考、四环素、磺胺、复方新诺明、美罗培南、替加环素、利奈唑胺耐药。综上,分离获得1株猪源阴沟肠杆菌,且耐药性较强。

猪流行性腹泻疫苗研究进展

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种猪急性、高度接触性的肠道传染病,由于其高发病率和高致死率,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。接种疫苗是当前预防PED最经济和有效的措施,但由于PEDV变异株的不断出现,疫苗的免疫保护效果不佳。因此,急需研发更加安全、高效的疫苗来预防PED。综述了PEDV的病原学特性、致病机制以及PEDV疫苗研究的最新进展,并对PEDV新型高效疫苗的研究策略进行展望,以期为临床上有效防控PED提供参考。

仔猪产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻仍然是困扰世界养猪业的重要疾病之一,产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌。在饲料中添加抗生素、喂服特异性抗体、膳食调节、利用遗传育种选育等多种方法被用来预防和治疗ETEC引起的感染。相比其他预防措施,疫苗接种是防制ETEC引起仔猪腹泻的最经济和最有效的手段。就目前猪用ETEC疫苗的最新研究进展进行综述,并分析了ETEC疫苗研究中面临的挑战,提出了高效疫苗的研究策略,旨在为ETEC新型、安全、高效和广谱疫苗的研发提供依据。

Ⅰ型菌毛对F18ac大肠杆菌粘附性能的影响

为研究Ⅰ型菌毛在F18ac大肠杆菌(F18ac E.coli)粘附过程中的作用,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了F18ac E.coliⅠ型菌毛主亚基编码基因fim A缺失突变株(F18ac△fim A),以野生株为对照,通过体外易感细胞粘附试验和生物被膜(BF)形成定量试验,探索Ⅰ型菌毛在F18ac E.coli粘附宿主细胞过程中的作用。体外易感细胞粘附结果显示,经8%甘露糖封闭Ⅰ型菌毛受体或fim A基因缺失后,F18ac E.coli对易感仔猪上皮细胞IPEC-1的粘附能力均显著下降。BF结晶紫定量试验显示,F18ac△fim A菌株形成BF的能力显著下降,而F18ac△fim A/pfim A回补株的粘附能力以及生物被膜形成能力均得到了恢复。本研究表明Ⅰ型菌毛是F18ac E.coli重要的粘附素,介导了F18ac E.coli对仔猪易感细胞的粘附过程。本研究为进一步阐释F18ac E.coli致病机制中多毒力因子的作用提供了实验依据。

鞭毛对F18^+大肠杆菌体外生物被膜形成影响的研究

为研究鞭毛在F18+大肠杆菌(F18+E.coli)生物被膜(BF)形成过程中的作用,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了F18+E.coli鞭毛素编码基因(fliC)缺失突变株(F18+△fliC)。以野生株为对照,通过在细胞表面形成典型微菌落试验以及BF的定性和定量试验,比较F18+△fliC菌株在体外形成BF能力的变化。吉姆萨染色结果表明,F18+△fliC菌株在IPEC-J2细胞表面形成典型微菌落数减少。BF体外试管培养定性试验和结晶紫定量试验均表明,F18+△fliC菌株形成BF的能力下降。本研究表明鞭毛在F18+E.coli体外BF形成过程中发挥了重要的作用,为进一步研究F18+E.coli的致病机制提供了实验依据。

FimH黏附素对F18ac+大肠杆菌黏附能力和生物被膜形成能力的影响

为研究Ⅰ型菌毛FimH黏附素在F18ac+大肠杆菌(F18ac+E.coli)致病机制中的作用,采用λ-Red同源重组方法成功构建了F18ac+E.coli的fim H基因缺失株(F18ac△fim H)。并使用体外仔猪上皮细胞感染模型,探讨FimH黏附素缺失后对F18ac+E.coli黏附能力和体外生物被膜形成能力的影响。结果表明,与野生株相比,F18ac△fim H缺失株对易感仔猪上皮细胞系IPEC-1和IPEC-J2的黏附能力和体外生物被膜形成能力均显著下降,且其黏附能力可被8%的D-甘露糖所抑制。但是F18ac△fim H/pfim H回补株的黏附能力以及生物被膜形成能力均基本恢复至野生株水平。可见,FimH黏附素是介导F18ac+E.coli黏附的重要黏附因子。

K88ac^(+)产肠毒素大肠杆菌eltAB基因缺失对其生物学特性影响的研究

为研究热敏肠毒素(LT)对K88ac+产肠毒素大肠杆菌(K88ac^(+)ETEC)致病能力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了eltAB基因缺失株C83902ΔeltAB,同时将重组质粒pBR322-eltAB电转化至C83902ΔeltAB菌株中获得回补株C83902ΔeltAB/pLT。比较3株菌的生长特性,结果显示相同的条件下,野生株、缺失株和回补株的生长速度无差异;采用ELISA方法检测3株菌感染仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2后细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)浓度,结果显示与缺失株相比,野生株和回补株感染后细胞内的cAMP浓度均极显著上升(P<0.01)。体外对IPECJ2细胞的黏附试验结果显示,缺失株的黏附能力较野生株极显著下降(P<0.01);而回补株的黏附能力得到恢复。采用RT-qPCR检测3种菌株感染IPEC-J2后炎性因子和紧密连接蛋白基因的转录水平,结果显示缺失株感染IPEC-J2细胞后,炎性因子TNF-α和IL-8的mRNA转录水平均极显著下降(P<0.01),而3株菌感染的细胞中紧密连接蛋白编码基因Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA转录水平均无变化。以上结果表明,LT毒素能够促进K88acETEC菌株对IPEC-J2细胞的黏附和诱导其炎性细胞因子的分泌,但并不能破坏肠道细胞屏障的完整性。本研究为进一步阐明K88acETEC的致病机制提供了重要的参考依据,同时为防治K88acETEC的感染提供了新的策略。

多重PCR快速检测食品中单核细胞增生性李斯特菌检测分析

研究应用多重PCR方法检测单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogen,LM)的三种特异性毒力基因iap、hly、Inl,相应扩增片段分别为457 bp、745 bp、562 bp。引物特异性和菌株特异性试验均表明3对引物具有很高的特异性。在对食品中LM进行检测时,整个检测过程在16 h内,检测灵敏度达到2 cfu·g-1样品,检测阳性结果与GB 4789.30-2010方法的完全一致。我们的试验结果表明建立的多重PCR是LM检测的一种快速、灵敏和特异性强的检测方法。

F18^+大肠杆菌研究进展

表达F18菌毛的大肠杆菌（Escherichia coli）是引起断奶仔猪腹泻（Post-weaning diarrhea,PWD）和水肿病（Oedema disease,ED）的主要病原菌.由于至今世界范围内仍无有效的疫苗进行预防,给养猪业造成了重大的经济损失.本文结合本实验室的一些相关研究结果,通过综述F18＋E.coli的病原特征、主要毒力因子、F18菌毛受体及针对抗F18＋E.coli感染疫苗研究的一些最新进展,以便加深对F18＋E.coli致病机制的了解,为临床中有效的防治该疾病提供相关的实验依据.

鲜食葡萄采后微生物病害及防治

中国是世界上鲜食葡萄生产量最大的国家,鲜食葡萄作为国民日常主要水果之一,有着无法替代的地位。2014年,世界鲜食葡萄年总产量为2 055万t,而中国的鲜食葡萄年产量就已达到900万t,占世界总产量的43%;同时,中国也是鲜食葡萄的消费大国,葡萄生产基本供应国内市场,还有20万t左右的进口[1]。鲜食葡萄是我国葡萄产业的主体,但由于葡萄果肉柔软多汁,含糖量和含水分量高,在采摘、贮藏、运输中极易受到机械损伤和病原菌的侵染,每年因此而造成鲜食葡萄的损耗约占销售总量的20%以上[2],浪费相当巨大。文章对葡萄采后的几种主要微生物病害和常用的防治方法进行概述。

大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅰ和卵清蛋白融合蛋白的表达及免疫原性分析

为探究大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅰ(Heat-stable toxin typeⅠ,STa)和鸡卵清蛋白(Chicken ovalbumin)串联表达的3×STa-ovalbumin重组融合蛋白的免疫原性,原核表达融合蛋白后,经SDS-PAGE和Western blot方法鉴定,将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,利用ELISA方法测定免疫小鼠血清中抗STa抗体的滴度,应用体外中和试验检测抗体对STa毒素的中和作用。SDSPAGE检测结果显示,融合蛋白分子质量约42 ku;Western blot分析结果显示,融合蛋白可被STa阳性血清特异性识别。小鼠免疫试验结果表明,融合蛋白具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗STa抗体滴度达到2.33,并且产生的抗体能在体外中和STa的毒性作用。以上结果表明,3×STaovalbumin融合蛋白具有良好的免疫原性。

酵母双杂交体系的原理及研究进展

阐述酵母双杂交技术能辨别两未知蛋白的相互作用,描述两己知相互作用蛋白的特征,控制蛋白的相互作用。与传统的生化和遗传学方法比较起来有明显的优势,得到愈来愈广泛的应用,并且在此过程中衍生了基于不同适用范围和不同物种的杂交技术。等酵母双杂交的原理及酵母双杂交体系的研究进展。

细菌鞭毛蛋白免疫佐剂活性作用机制及应用研究进展

鞭毛是位于细菌表面的一种长丝状附属物,由基体部(Basal body)、鞭毛钩(Hook)和鞭毛丝(Fila-ment)3部分组成,其中fliC是鞭毛蛋白编码基因的主要结构成分。鞭毛蛋白是一种重要的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),能激活细胞表面Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)[1]和/或细胞溶质NOD样受体蛋白4(NLR family CARD domain-containing protein 4,NL⁃RC4)[2],发挥免疫佐剂活性[3-4]。

研究生值班制度在高校兽医检测专业实验室建设管理中的实践

高校兽医检测实验室面对社会接收样品,提供兽医诊断和病原检测服务,对样品接收、处理有时效性要求;同时对整个实验室的人、机、料、法、环等要素有着较高要求。依靠高校全职工作人员对专业兽医检测实验室进行全面管理,限于效率不高、样品接收不够及时、周末及假期无人值班、环境要素有时无人监控等问题。通过对研究生值班制度的摸索、实践,使得以上问题得到基本解决。本文介绍了该制度运行模式、实行要点,总结了相关的管理经验及体会。

大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与F4菌毛主要结构亚单位FaeG嵌合基因的构建及其表达蛋白的功能研究

为探究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与其免疫佐剂活性的相关性,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)分别构建了出血性大肠杆菌EDL933(O157􀏑H7)鞭毛蛋白FliCH7基因的全长(aa1~aa585)、N端保守区(aa1~aa174)、N端加中间的高变区(aa1~aa496)与产肠毒素大肠杆菌F4ac+国内标准株C83902(O8􀏑K88􀏑H19)主要亚单位FaeG串联表达的嵌合基因,即FliC-FaeG、FliCN-FaeG和FliCNV-FaeG,分别将其克隆至pET-28a(+)表达载体中经IPTG诱导表达;经SDS-PAGE和western blot分别对表达的融合蛋白进行鉴定。PCR结果显示3个嵌合基因分别约为2600 bp、1300 bp和2300 bp;SDS-PAGE结果显示融合蛋白的大小分别约为:90 ku、48 ku和80 ku,均与预期大小一致。Western blot结果表明3种融合蛋白均能被抗FaeG的单克隆抗体识别;表明融合蛋白中FaeG仍维持其独立的结构和生物学活性。抗FliCH7的抗体可识别FliC-FaeG和FliCNV-FaeG融合蛋白,而FliCN-FaeG融合蛋白不含鞭毛蛋白高变区,所以不能被识别;TLR5受体活性检测结果表明,仅FliC-FaeG融合蛋白能激活TLR5受体,引起IL-8、TNF-α炎性因子的分泌,以上结果表明TLR5受体活性的激活需要完整的鞭毛蛋白结构,本研究以FaeG为模型抗原,构建了大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与其相结合的融合蛋白,为进一步研究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域免疫佐剂活性的差异性和深入研究鞭毛蛋白发挥其免疫佐剂活性的机理提供了参考依据。

志贺氏菌样毒素Stx2e缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

水肿病是能由产志贺样毒素型大肠杆菌产生的Stx2e毒素引起的一种细菌传染病,对断奶仔猪有较高的致死率,常造成较大的经济。当前,Stx2e毒素影响病原菌与靶细胞之间的相互作用机制不明确,Stx2e基因缺失株作为后选疫苗的潜力有待确认。本研究中我们利用Red重组系统构建了大肠杆菌1522(serotype O139:K12:H1)和1525(serotype O157:H19)的Stx2e基因缺失株,并通过PCR检验,DNA测序手段以及Vero细胞毒性试验在细胞水平加以验证。研究发现,在同样的培养条件下,1522△Stx2e株的生长特性与原型株相比没有差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变,但是相较野生株,Stx2e基因缺失株粘附猪肠上皮细胞IPEC-J2的能力大幅度降低,可达30%。将表达K99菌毛操纵子基因克隆入1522△Stx2e中,该重组菌能够同时表达K99菌毛和自身的F18菌毛基因,且该重组株的粘附IPEC-J2细胞能力相较原型株增强近1倍。

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的表达及其对该菌的特异性检测研究

为获得肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白并检测其生物学功能,本研究以肠炎沙门氏菌标准株SE50336为模板,PCR扩增其含分泌信号肽的sef14操纵子基因片段,并克隆至表达载体pBR322中,构建重组质粒pBR322-sef14,将该重组质粒转化至经修饰且不含任何菌毛的大肠杆菌SE5000M株中,获得重组菌pBR322-sef14/SE5000M。将重组菌pBR322-sef14/SE5000M与本实验室制备的SefA(SEF14菌毛的主要亚基)单克隆抗体(MAb)凝集;利用透射电镜和免疫电镜观察上述重组菌并通过SDS-PAGE和western blot鉴定,利用该重组菌pBR322-sef14/SE5000M与肠炎沙门氏菌阳性鸡血清及其他菌的阳性鸡血清结合。结果显示,本实验室制备的SefA MAb能够特异性识别该重组菌,并产生明显的肉眼可见的凝集反应。重组菌表达的SEF14菌毛产物大小约为14.3 ku,与菌毛的主要亚基SefA的大小一致,电镜观察到重组菌表面有明显的菌毛结构。在肠炎沙门氏菌特异性靶向检测中,该重组菌表达的菌毛蛋白仅与肠炎沙门氏菌阳性鸡血清反应,能够在2 min内用肉眼观察到清晰的凝集颗粒,而不与鸡白痢、鸡伤寒、鼠伤寒沙门氏菌阳性鸡血清反应。本研究首次克隆了肠炎沙门氏菌sef14操纵子基因并在体外成功表达并进行了功能鉴定,上述研究结果为进一步研究SEF14菌毛及建立特异性诊断技术提供基础。

细菌Ⅷ型分泌系统的研究进展

细菌为了促进生物被膜(Biofilm,BF)的形成、提高对宿主细胞的黏附和定植能力,进化出了许多简洁的机制,用来加工、组装和分泌相应的功能性蛋白[1]。目前已经在细菌中发现了9种分泌系统,包括:Ⅰ型分泌系统(Type Ⅰ secretion system,TISS)由3种蛋白(内膜ABC转运蛋白、周质膜融合蛋白和外膜孔蛋白)组成跨细胞双层膜的复合物,使分泌的蛋白一次性穿过内外膜分泌到胞外[2];Ⅱ型分泌系统(T2SS),与V型分泌系统(T5SS)的蛋白均依赖内膜上的Sec转位酶进入细胞周质,再利用β折叠桶实现跨外膜分泌[3];Ⅲ型分泌系统(T3SS)较复杂,效应蛋白利用针状复合体以注射的方式注入宿主细胞内[4]。