流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化

为了表达流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056bp,以包涵体的形式表达约40ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。

流行性乙型脑炎病毒NS4B蛋白的原核表达及其结构分析

为了解流行性乙型脑炎病毒NS4B蛋白的结构及功能,本研究构建了乙脑病毒P3株ns4b基因原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达蛋白,并通过Western blot确定所表达蛋白为目的基因的产物。DNAStar软件分析其核苷酸和氨基酸序列特征,建立遗传进化树,利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构等方面进行预测。结果显示,P3株ns4b基因全长765 bp,GC含量54.64%,包含21个酶切位点,与其他毒株的遗传距离为0.8,说明ns4b基因非常保守;编码255个氨基酸,预期大小为27 KDa,其中有20个强碱性氨基酸、15个强酸性氨基酸,等电点为9.24,为碱性蛋白,中性环境中带正电。生物信息分析表明NS4B蛋白无信号肽,有3个跨膜区域;无糖基化位点,磷酸化位点26个;亲水性良好;其蛋白二级结构有较多α-螺旋与无规则卷曲,中间较大的螺旋和两端的无规则卷曲构成其特殊三级结构。试验成功构建了原核表达载体pET42b-NS4B,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达较大量蛋白,大小与预期一致。JEV-ns4b是该病毒较为关键的非结构蛋白基因,可通过原核表达系统高效表达蛋白,研究其蛋白功能,有助于进一步优化乙型脑炎疫苗。