斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的表达及鉴定

目的 获得表达斯氏狸殖吸虫半胱蛋白酶基因片段编码多肽 ,对其免疫反应性作初步研究 ,在吸虫所致疾病的血清学诊断的应用奠定基础。方法 用PCR法扩增目的基因片段 ,1%琼脂糖凝胶回收纯化后与PinPointT载体相连 ,并导入到大肠杆菌JM10 9菌株中去 ,诱导表达其编码的多肽片段。用裂解液制备抗原标本 ,经SDS PAGE电泳后 ,经考马斯亮蓝和生物素链亲合素碱性磷酸酶染色检测其表达情况 ,Westernblotting鉴定其免疫反应性。结果 转化实验共获得8株阳性重组子 ,经测序鉴定证实仅 1株正向连接。经过诱导表达 ,制备重组抗原标本 ,经SDS PAGE、转膜后生物素 链亲和素 碱性磷酸酶系统染色显示在 3 2× 10 3处有一融合蛋白条带 ,反向连接菌株与之相似 ,也出现一条表达带 ,但分子量远小于预期值 ,仅仅 14× 10 3左右。Western blotting显示仅正向连接菌株在 3 2× 10 3的位置有一阳性染色条带。结论 成功的构建了斯氏狸殖吸虫半胱氨酸蛋白酶的原核表达载体 ,经过诱导后表达的重组抗原 。

人PD1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1(+)片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1(+)表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。

鼠B7-H4基因重组腺病毒的构建及其在B16F10细胞中的表达、鉴定

目的构建表达鼠B7-H4的重组腺病毒并检测其在B16F10细胞中的表达。方法采用RT-PCR技术,取小鼠肺脏,TriPure提取肺脏总RNA,反转录得到cDNA序列,PCR扩增B7-H4全长,克隆到plenti6/V5克隆载体中并经过测序证实与标准序列一致。加入适当的酶切位点,双酶切PCR扩增产物连接入pAd track CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAd track CMVmB7-H4,经酶切线性化后,用CaCl2的方法转化到含有腺病毒骨架质粒pAd Easy的BJ 5183大肠杆菌中,挑选同源重组菌落提取质粒,酶切线性化重组质粒并转染293细胞,包装成重组病毒颗粒。重组病毒上清感染B16F10细胞,并用PE标记的B7-H4单克隆抗体检测B16F10细胞mB7-H4蛋白的表达。结果RT-PCR扩增得到含编码mB7-H4的860 bp基因片段,与预期大小一致,并经过测序证实与标准序列一致。成功构建了mB7-H4重组腺病毒,病毒滴度达到3×1013pfu/ml,pAd mB7-H4重组腺病毒表达载体感染B16F10细胞后,荧光显微镜观察显示PE标记的mB7-H4单克隆抗体染色B16F10细胞阳性。结论成功构建了mB7-H4重组腺病毒,转染B16F10细胞后表达出有活性的B7-H4蛋白,为进一步研究B7-H4分子在器官移植、自身免疫性疾病以及肿瘤逃逸机制中的作用奠定了基础。

B7-H4——免疫调控以及肿瘤治疗的新靶点

B7-H4又称B7s1或B7x,是B7家族中的最新发现的一个新成员,它能通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期的进程来负性调控T细胞的免疫应答,同时大量表达B7-H4还可以促进上皮细胞的恶性转化,保护表皮细胞免于失巢凋亡,在肿瘤的发生,进展和转归中发挥重要作用。对B7-H4信号通路的进一步的研究必将为自身免疫性疾病、病毒感染性疾病和器官移植后排斥反应中T细胞介导的免疫应答调控提供了新的途径,同时也为肿瘤的诊断、治疗提供崭新的策略。

cDNA疫苗预防寄生虫感染的优势与缺陷

近年来DNA疫苗技术的快速发展 ,为研制能有效激活机体的体液免疫和细胞免疫机制的多价疫苗提供了良好的前景。cDNA疫苗的出现为一些重要的寄生虫病 ,如疟疾、利什曼病、弓形虫病、血吸虫病、片形吸虫病的预防提供了可能性。然而接种疫苗的效果更多取决于疫苗的接种方式、剂量、接种途径、疫苗接种宿主的种甚至是株。为了解决上述问题 ,还需要作进一步的研究工作 ,尤其是后续新的cDNA序列的克隆及检测 ,基因组计划 ,疫苗的不同接种方法 。

动态心电图对冠心病无症状性心肌缺血的临床诊断价值

目的探讨动态心电图(DCG)在无症状性心肌缺血(SMI)中的诊断价值。方法 90例拟诊冠心病患者均进行24 h DCG及冠脉造影检查,分析DCG在SMI及冠心病中的应用价值。结果 90例患者行DCG检查诊断为无症状SMI患者55例,24 h内发作157次;有症状SMI患者9例,24 h内发作45次。DCG诊断无症状SMI组与有症状SMI组患者的ST段压低幅度比较,差异无统计学意义(P>0.05);无症状SMI组的持续时间>1 min的患者比例为69.09%,显著高于有症状SMI组的33.33%(P<0.05)。DCG诊断SMI灵敏度为82.26%、特异度为85.71%、误诊率为14.29%、漏诊率为17.74%。结论 DCG诊断无症状性心肌缺血有较高临床价值,可以作为一种简易、无创的诊断手段应用于临床。

并指(趾)畸形的分类及遗传学研究进展

并指(趾)畸形(syndactyly,SD)是最常见的遗传性肢体畸形,表现为某些手指或脚趾的融合。这类畸形可单独出现,也可以作为300多种综合征的一个体征出现。SD在家庭间及家庭内部具有显著的临床异质性。即使在同一个体中,表型也可表现为单侧或双侧,对称或不对称。目前,已经报道的非综合征型的SD至少9种,主要遗传模式为常染色体显性遗传,其次是常染色体隐性遗传及X-连锁隐性遗传。其中Ⅱ-a,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ型的SD致病基因及其突变位点已经找到,其他SD的遗传学机制仍然未知。在Sajid Malik分类的基础上,系统总结近几年SD的遗传研究成果,以期为该病机制的深入研究和临床诊断提供帮助。

小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定

目的：体外建立小鼠小胶质细胞补体攻膜复合物亚溶破模型，并进行功能鉴定，探讨补体攻膜复合物（sublytic membrane attack complex，sMAC）对中枢神经系统小胶质细胞的亚溶破刺激效应，方法：分离培养新生小鼠大脑皮层小胶质细胞，用酵母多糖激活急性期患者血清制备补体优球蛋白C56，以新鲜正常人血清（NHS）作为C7-C9来源，体外组装小鼠小胶质细胞sMAC亚溶破模型，CCK-8比色实验确定sMAC亚溶破剂量，激光共聚焦显微镜（LSCM）鉴定sMAC沉积，脱落细胞计数及台盼蓝拒染法分别判定细胞黏附力变化及脱落细胞活力．ELISA法测定sMAC对小胶质细胞NO和TNF—α分泌量的影响．结果：确定C561：480，NHS1：20为小胶质细胞亚溶破补体量；LSCM显示sMAC沉积于小胶质细胞表面；sMAC刺激小胶质细胞后与对照组相比细胞脱落增加（P〈0．05），而活力正常．刺激后12hNO及TNF-α分泌量比对照组显著增加（P〈0．05），不同时相观察sMAC刺激后小胶质细胞TNF—α分泌量均显著高于失活sMAC（P〈0．05）．结论：sMAC刺激小胶质细胞后分泌NO及TNF—α增多，并且可降低小胶质细胞黏附力而不影响细胞活力，推测sMAC对小胶质细胞具有炎性刺激效应．

基于CFSE染色的小鼠淋巴细胞体内示踪方法的建立

目的确定CFSE标记小鼠淋巴细胞的条件,建立简单快速、稳定可行的淋巴细胞体内示踪方法。方法利用流式细胞术分别检测不同浓度CFSE、不同悬浮溶液(1640培养基、PBS溶液)对小鼠淋巴细胞标记效果的影响,确定合适的标记条件;输注同品系CFSE标记的小鼠淋巴细胞,于不同时间点检测受鼠主要脏器内CFSE+细胞在淋巴细胞中的比例,并确定供鼠细胞的注射剂量;按照合适的注射剂量分别在注射后不同时间点测定供鼠细胞在受鼠体内的分布,考察本方法的稳定性及阳性信号的持续时间。结果 PBS组CFSE+细胞平均荧光强度分别为596、793、1123、1596、1737,明显高于1640培养基组(P<0.05);1640培养基组CFSE+细胞死亡率分别为8.7%、8.4%、8.6%、9.0%(P>0.05),而PBS组CFSE+细胞死亡率随着CFSE终浓度的上升而增加(P<0.05);按照不同剂量输注同品系淋巴细胞24h后,在受鼠各组织中检测到CFSE+细胞;每只小鼠尾静脉注射5×106个CFSE+淋巴细胞后,到d63仍可在组织中检测到阳性信号细胞。结论以PBS作为孵育液、CFSE终浓度选择10μmol/L对小鼠淋巴细胞标记、注射剂量为细胞5×106个/只,可使CFSE+细胞信号在同系小鼠体内持续2个月。

小儿先天性心脏病合并肺部感染的超声心动图分析

目的探讨小儿先天性心脏病(CHD)合并肺部感染时超声心动图表现。方法选取2011年7月至2014年6月济南军区总医院收治的CHD合并肺部感染患儿,观察感染控制前后患儿超声心动图表现。结果 CHD患儿肺部感染控制后,三尖瓣反流程度较控制前有显著好转(P<0.05);患儿肺部感染控制前肺动脉/主动脉收缩压比值为(0.89±0.21),显著高于感染控制后的比值(0.53±0.19),差异有统计学意义(P<0.05)。控制肺部感染前,室间隔缺损患儿心脏血流由左向右分流10例,由右向左分流8例;动脉导管未闭患儿心脏血流双向分流8例,由右向左分流4例;房间隔缺损患儿心脏血流由右向左分流8例。控制肺部感染后,室间隔及动脉导管未闭患儿心脏血流均为由左向右分流,房间隔缺损患儿心脏血流亦均为由左向右分流。结论 CHD患儿合并肺部感染时,室间隔缺损、动脉导管未闭患儿心脏血流并非全部表现为左向右分流,故超声心动图检查时应仔细分析。

融合蛋白ICOSIg的三维结构模建的研究

目的:利用结构相似性的序列比对来模建ICOSIg的三维结构,分析其可能的结合位点,为 改造ICOSIg的突变体,提高其结合活性提供理论基础。方法:利用生物信息学手段分析ICOS所 属CD28家族各成员分子的结构域,通过基于结构相似的序列比对,以空间结构已经得到解析的 CTLA4为模板,利用同源模建的方法,模建ICOS膜外区的空间结构。进一步地以人IgG2和 CTLA4为模板,模建了ICOSIg全长的空间结构。在此基础上,结合氨基酸特性,分析其可能的功 能位点。结果:FDPPPF及KTKGSGN基序可能是ICOSIg的功能结合位点。结论:模建了ICOSIg 的空间结构,分析了其可能结合位点,为突变ICOSIg提高其亲和力提供了线索。

TBX2基因3'非翻译区位点rs59382073与汉族人群散发型先天性心脏病的易感性密切相关

目的分析TBX2基因3＇UTR变异位点与汉族人群散发型先天性心脏病（CHD）的遗传易感性是否关联,初步探讨其可能的发病机制。方法纳入2010年8月至2012年4月山东济南军区总医院心血管病研究所诊断的非综合征型汉族CHD为CHD组,以同期医院和社区体检的健康儿童为对照组。选择CHD组和对照组各24例行TBX2 3＇UTR测序。根据测序结果在CHD组和对照组分别行SNa Pshot基因分型和关联分析;通过细胞转染及荧光素酶检测对阳性位点进行功能分析。结果 CHD组纳入768例,年龄（6.1±4.8）岁,男383例（49.9%）;对照组纳入660例,年龄（6.5±3.2）岁,男354例（53.6%）。124例CHD和24例对照行TBX2基因3＇UTR区测序发现3个已知的SNPs位点：rs59382073、rs1058004和rs729782,未检出新发SNPs位点。2样本采集中期CHD和对照组各288例样本的关联分析显示,rs59382073的基因型在CHD组和对照组的分布差异有统计学意义（P=0.012）;余2个SNPs在两组间差异无统计学意义（P〉0.5）,后续样本未行该2个SNPs检测。3全样本关联分析显示,TBX2 3＇UTR rs59382073位点与散发型CHD的患病风险密切相关,GT/TT基因型较GG基因型可导致CHD的患病风险增加2.13倍（OR=2.13,95%CI：1.51~2.99,P=1.44×10-5）;进一步分层分析显示,与GG基因型相比,GT/TT基因型增加2.75倍圆椎动脉干畸形（OR=2.75,95%CI：1.57~4.81,P=3.99×10-4）、3.18倍法洛四联症（OR=3.18,95%CI：1.53~6.61,P=1.90×10-3）和1.70倍室间隔缺损（OR=1.70,95%CI：1.17~2.46,P=5.14×10-3）的患病风险。4细胞水平的功能研究提示,与G等位基因相比,转染T等位基因可分别导致HEK293 T及H9C2细胞的荧光素酶活性下降29.2%和33.6%。结论 TBX2 3＇UTR rs59382073位点可显著增加汉族人群散发型CHD的患病风险;其不同等位基因的荧光素酶表达水平存在差异,为潜在的功能位点。

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆和表达

目的 克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,并进行原核表达。方法 利用简并引物 ,进行RT -PCR ,扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入 pUCm -T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。将获得的cDNA片段克隆入Pin PointTMXa- 1T表达载体 ,经过筛选后 ,在大肠杆菌中进行原核表达。通过SDS -PAGE电泳和Westernblot方法鉴定表达产物 ,并检测所表达融合蛋白的免疫反应性。结果 RT -PCR扩增出了一 5 0 0bp左右的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 4 98bp。推导出的氨基酸序列长 16 6 ;氨基酸序列的同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺残基高度保守。原核表达中 ,对表达产物的鉴定结果和免疫反应性检测结果均显示 ,目的克隆在 33kDa处有一明显条带。结论 本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,其序列中包含了与该酶活性有关的重要位点。原核表达获得一 33kDa的融合蛋白 ,该融合蛋白具有免疫反应性。

斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因pET22b载体的构建及表达

目的构建含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的pET22b(+)表达载体,利用SDSPAGE和免疫印迹分析阳性克隆菌株的诱导表达及其表达产物的免疫原性。方法提取斯氏狸殖吸虫成虫总RNA,经RTPCR扩增及T/A克隆后测定其核苷酸序列并进行序列查询与比对。根据已获得的序列和pET22b(+)载体的内切酶位点信息设计引物并再次进行T/A克隆,阳性克隆质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段与pET22b(+)载体连接并转化至BL21(DE3)菌株,收集经IPTG诱导表达后的菌液进行SDSPAGE和免疫印迹分析。结果SDSPAGE显示,经诱导表达的阳性克隆菌株、未经诱导菌株与空载体菌株之间的蛋白带型未见明显差异,但经诱导表达的阳性克隆菌株的22ku蛋白条带比另两菌株明显,免疫印迹证实,该蛋白条带可与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生强阳性反应。结论成功构建了含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因的pET22b(+)载体,经诱导表达的融合蛋白能与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生较强的免疫反应。

实验猪血流量及压力测定的麻醉管理

目的探讨实验猪血流量及压力测定的麻醉管理,评价该实验期间麻醉效果。方法巴马香猪10头(雄雌各半),体重35～40 kg,月龄5～6个月。术前12 h禁食,6 h禁水。麻醉前15 min在臀大肌肌肉注射氯胺酮10mg/kg,阿托品0.02 mg/kg,咪达唑仑0.1 mg/kg作基础麻醉。开放耳缘静脉,颈内静脉置F5双腔管,监测心电图、脉搏血氧饱和度(SPO2;可夹在舌头上),鼻咽温,股动脉置20号套管针监测动脉压。麻醉诱导氯胺酮10 mg/kg,速眠新Ⅱ0.1 mg/kg联合静脉注射,保留呼吸行气管插管,压力控制呼吸,潮气量8～12 ml/kg,空氧混合气体吸入。麻醉维持速眠新Ⅱ0.1 mg/kg追加1次/60 min,辅助异氟醚0.8%～1.4%吸入。实验方法:实验猪取仰卧位,胸骨正中切口,前腔静脉近心端、远心端,主肺动脉瓣上1 cm,左、右肺动脉起始部,缝制荷包线,插套管针连接压力感受器、测量血管内压力,测压完成后,应用Veri Q 4221流量仪,测量上述部位血管流量。结果实验中基础麻醉效果较好,气管插管一次成功,无麻醉死亡;麻醉维持稳定,血流动力学平稳,术中无疼痛反射,肌肉松弛良好,总时间2.5～3.0 h,实验结束后均在10～15 min内恢复呼吸,一次拔除气管导管,无感染,24 h进食,放养于猪舍内至今全部存活。结论麻醉处理合理,效果良好,麻醉方法可行性强,用药合理,保障实验顺利进行。

斯氏肺吸虫半胱氨酸蛋白酶的原核表达及其免疫活性分析

目的 对克隆的斯氏肺吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA进行原核表达并检测其免疫反应性。方法 利用PinPointTM Xa 1T表达载体系统 ,对已克隆的斯氏肺吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段在大肠杆菌中进行原核表达。通过SDS PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物 ,分别检测所表达融合蛋白的分子量和免疫反应性。结果 SDS PAGE结果显示 ,与对照相比较目的克隆在 3 3× 10 3处有一明显差异带。Westernblot结果则表明有一阳性条带出现 ,分子量为 3 3×10 3。结论 通过原核表达获得斯氏肺吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA的表达融合蛋白 ,分子量为 3 3× 10 3;

重组VIP腺病毒载体的构建及其在293细胞的表达

目的构建血管活性肠肽重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究。方法利用RT-PCR扩增小鼠大脑VIPmRNA,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,在pAdeasy内同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测。PCR、免疫荧光鉴定pAdeasy-VIP感染293细胞后VIP基因的表达,ELISA检测重组病毒转染后293细胞上清中的表达。结果测序、酶切证实VIP基因重组腺病毒载体构建成功。RT-PCR,免疫荧光检测pAdeasy-VIP病毒感染的293细胞,均有VIP的表达。与对照组相比,重组病毒转染后293细胞上清中VIP多肽的表达明显增高。结论成功构建了含小鼠VIP基因的重组腺病毒载体,并成功表达VIP多肽。