稳定表达CD19的非小细胞肺癌细胞系的构建

细胞系表达的CD19可被靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)特异性识别。为探究靶向CD19 CAR-T抗肿瘤疗效及机制提供可靠稳定的靶细胞系,运用Lipofectamine 3000 TM脂质体转染法将pPBDP-CD19和pSPBT质粒转入A549细胞。嘌呤霉素(Puro)筛选,稳定细胞株A549-CD19单克隆细胞由有限稀释法得到;RT-qPCR鉴定A549-CD19细胞系中CD19 mRNA的表达;流式细胞术检测A549-CD19中CD19的表达;MTS法比较改造前后细胞系的生长活性变化。经Puro抗性筛选和挑取单克隆,得到4个A549-CD19单克隆细胞;RT-qPCR鉴定A549-CD19细胞系均有CD19 mRNA高表达;流式检测单克隆细胞系阳性率均达到99%;MTS法检测发现A549-CD19细胞系与亲本细胞A549细胞具有一致的生长活性。运用PiggyBac转座系统构建稳定表达CD19的A549-CD19细胞系成功,为评估靶向CD19实体瘤CAR-T疗效提供靶细胞,奠定CAR-T细胞抗实体瘤疗效机制研究基础。

表达近红外荧光蛋白的结肠癌细胞系的建立

通过PiggyBac转座子系统,构建能够稳定表达近红外荧光蛋白iRFP720的CT26鼠结肠癌细胞株,通过嘌呤霉素筛选获得CT26-iRFP720单克隆细胞株。流式细胞仪验证表明所得CT26-iRFP720细胞株纯度为98.1%;Western Blot检测结果表明,iRFP720基因的引入不会改变细胞PD-L1的表达。将构建成功的细胞株植入BALB/c小鼠皮下,成功建立CT26-iRFP720肿瘤模型,且利用动物活体成像可以观察到iRFP720的表达。结果表明稳定,可实时观察的CT26-iRFP720结肠癌BALB/c小鼠模型成功建立。

萤火虫荧光素酶标记结直肠癌模型的建立

针对小鼠结直肠癌细胞(CT26)构建能够稳定表达萤火虫荧光素酶Firefly luciferase(Fluc)以及具有嘌呤霉素抗性的CT26-Fluc细胞株,并建立其荷瘤鼠模型。采用同源重组技术将Firefly luciferase基因片段整合至转座子系统中得到质粒,将所得质粒转染进入CT26原始细胞株,使其在该细胞内表达。后通过细胞敏感性实验获得CT26最低致死浓度,筛选获得稳定表达荧光素酶的CT26-Fluc单克隆细胞系。流式细胞仪检测CT26-Fluc单克隆的纯度。同时利用显微观察等方法证实细胞增殖和细胞形态与CT26原始细胞系不存在显著差异。将构建成功的CT26-Fluc植入BALB/c小鼠右后侧背部皮下,通过小动物活体成像仪验证该细胞系能稳定表达荧光素酶,且能够用于小鼠结直肠癌成瘤模型。本实验成功构建了稳定表达Firefly luciferase的CT26-Fluc细胞系,为小鼠结直肠癌模型及其病灶转移机制的研究建立了技术基础。

稳定表达荧光素酶BGC823细胞系的构建

目的:建立稳定表达荧光素酶的人胃癌细胞系(BGC823),为建立活体成像的人胃癌裸鼠移植瘤模型及治疗研究奠定基础。方法:含绿色荧光蛋白(GFP)及荧光素酶的质粒用脂质体转染法稳转到胃癌细胞BGC823中。不同浓度的嘌呤霉素用于筛选细胞,单克隆细胞用有限稀释法挑选,用流式细胞仪检验构建的BGC823-FLuc细胞的纯度。细胞的荧光素酶表达量用荧光素酶底物试剂检测。MTS比较改造前后BGC823细胞的增殖。结果:流式检测显示单克隆细胞系阳性率达到99.9%,且多功能酶标仪检测到荧光信号值。MTS法检测发现改造前后细胞增殖基本一致,说明加入荧光素酶基因未对细胞增殖产生明显影响。结论:表达荧光素酶及绿色荧光蛋白的单克隆胃癌细胞系构建成功。此细胞系具有可用于体外及体内实验以研究肿瘤模型的优势的。

PBAE 447的合成鉴定及其基因传递效率

PBAE 447是一种能够携带负电DNA进入细胞进行表达的阳离子聚合物。通过4-氨基-1-丁醇和1,4-丁二醇二丙烯酸酯进行加成反应,并加入1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪封端合成PBAE 447,所得产物数均分子量大小为17586,并使用ICP4、LoVo、B16R,CT-26做为转染用细胞系,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因。结果表明,PBAE447能够携带基因进入多种肿瘤细胞系进行表达。

稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系的构建及鉴定

实体瘤缺乏明确的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)治疗靶点。因此,通过慢病毒将已经明确的靶点分子CD19带入实体瘤细胞系,研究CD19 CAR-T细胞对其的杀伤,能够为CAR-T细胞针对实体瘤的治疗提供潜在的支撑。本研究利用三质粒慢病毒系统构建了稳定表达CD19、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLUC)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的结肠癌CT26细胞系CT26-CD19-FLUC-GFP。该细胞系与CT26细胞系的生长活性一致。通过流式细胞术检测不同代次CT26-CD19-FLUC-GFP细胞,证实了CT26-CD19-FLUC-GFP细胞连续传代至第5、10、22代后CD19及GFP的稳定表达。进一步证实,连续传代至第22代的CT26-CD19-FLUC-GFP细胞中的CD19 mRNA及FLUC表达水平显著高于对照组CT26细胞。与T细胞相比,CD19CAR-T细胞能够显著杀伤CT26-CD19-FLUC-GFP细胞及MC38-CD19细胞。CT26-CD19-FLUC-GFP细胞腹腔植入小鼠体内1周后,通过活体成像仪可以检测到腹腔区域的FLUC表达。上述结果表明,成功构建了稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系,且该细胞系能够被CD19 CAR-T细胞特异性杀伤。

溶瘤病毒联合CAR-T细胞治疗实体瘤研究进展

嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)疗法属于肿瘤免疫治疗的范畴。该疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中表现优异,但在实体瘤治疗中存在诸多挑战。近年来,溶瘤病毒(oncolytic viruses,OVs)在针对黑色素瘤、脑胶质瘤等实体瘤适应证的临床试验中展现出良好的疗效。溶瘤病毒一方面选择性地在肿瘤细胞中复制杀伤肿瘤细胞,另一方面通过激活机体自身的免疫系统发挥抗肿瘤作用。因此,溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂、肿瘤浸润淋巴细胞疗法(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)等免疫疗法的联合应用也在广泛开展。目前研究表明,溶瘤病毒不仅能够增加CAR-T细胞的抗肿瘤活性,而且通过传递肿瘤相关抗原或特异性抗原来增强CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用,同时溶瘤病毒还可以帮助CAR-T细胞克服免疫抑制性的肿瘤微环境。两种疗法的联合应用在临床前研究中展现出了良好的疗效和安全性,能够解决CAR-T在实体瘤治疗领域的瓶颈,具有广阔的临床转化前景。本文就溶瘤病毒与CAR-T细胞联合治疗实体瘤的药效及相关机制研究展开论述。

NF-κB在非小细胞肺癌中的作用及治疗研究

核因子-κB (nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)通过多种信号通路调控细胞生命代谢活动,同时它在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)形成、侵袭、转移及血管生成等过程中扮演重要角色。NF-κB在NSCLC中处于高度活化的状态已被证实,开发运用NF-κB抑制剂并联合放化疗等手段治疗NSCLC患者的策略取得重大进展。此外,NF-κB通过改变肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中免疫/炎症细胞的分化与功能,抑制或促进NSCLC的生长和转移。因此,靶向NF-κB疗法能够抑制NSCLC的生长和转移、减少炎性因子的分泌并增强抗肿瘤免疫应答,但也要避免NF-κB活性的抑制对免疫系统的弱化。该文对NF-κB在NSCLC中的作用及治疗研究进行概述。