大鼠海马神经干细胞体外增殖、凋亡和分化的激光扫描共焦显微镜观察

目的采用激光扫描共焦显微镜观察体外培养胎鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖、凋亡及其分化情况。方法体外分离培养胚胎大鼠海马NSCs,把神经干细胞球培养在共焦显微镜专用培养皿中。用Hoechst33258染细胞核,免疫荧光细胞化学技术检测巢蛋白(Nestin)的表达以鉴定NSCs,检测神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲtubulin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达以测定NSCs的分化能力。通过激光扫描共焦显微镜对神经干细胞球进行光学连续断层扫描,然后用软件进行三维重建,立体动态观察神经球。结果通过激光扫描共焦显微镜观察到神经球Nestin阳性表达,NSCs的突起随着发育逐渐增长,并相互缠绕,经2次传代后培养7d的NSCs凋亡率为(8.60±2.20)%。在血清诱导下分化后的细胞突起从细胞球向四周呈放射状迁移,且突起相互交错成网状。经2次传代后诱导分化7 d的NSCs分化为星形胶质细胞和神经元的比例分别为(68.60±7.64)%和(29.90±8.22)%(P<0.01)。结论对大鼠神经干细胞球的增殖、凋亡及分化的观察激光扫描共焦显微镜发挥了独特的优势。

大鼠少突胶质细胞转录因子2基因真核表达载体的构建

背景:碱性螺旋-环-螺旋转录因子少突胶质细胞转录因子2在脊髓的少突胶质细胞的分化过程中起着关键性的作用。目的:构建大鼠少突胶质细胞转录因子2基因重组真核表达载体,观察其在真核细胞内的表达。方法:从新生大鼠脊髓组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后将少突胶质细胞转录因子2cDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接。将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-Olig2以脂质体法转染至COS-7细胞中,反转录PCR鉴定少突胶质细胞转录因子2mRNA的表达,免疫印迹法检测少突胶质细胞转录因子2蛋白质表达水平。结果与结论:克隆了少突胶质细胞转录因子2的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-Olig2,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;转染72h时免疫印迹分析显示,COS-7/pEGFP-N1-Olig2实验组COS-7细胞表达Olig2-GFP融合蛋白。提示实验成功构建pEGFP-N1-Olig2真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达。