手持拉曼光谱仪在抗体类药物鉴别中的应用研究

目的:基于主成分分析(PCA)算法的Trutools模式,利用手持拉曼光谱仪建立快速鉴别抗体类药物的方法。方法:通过选取抗PD-1抗体、抗VEGF抗体、抗Her-2抗体,采集拉曼光谱数据,建立数据模型,分别对3种抗体进行鉴别。选择其中一种抗PD-1抗体,采用加热和光照两种条件对其进行加速降解处理,利用手持拉曼光谱仪对加速降解的抗体进行检测,研究所建方法能否检出加速降解的抗体。并通过分子排阻色谱(SEC-HPLC)、离子交换色谱(IEC-HPLC)及竞争结合酶联免疫吸附测定(ELISA)法对加速降解的抗体进行检测,与拉曼光谱检测结果进行比较。结果:通过建立的拉曼光谱数据模型可以鉴别3种不同类型的抗体,且拉曼光谱可以鉴别加速降解后的抗PD-1抗体。结论:手持拉曼光谱仪可以用来快速鉴别抗体类药物。本研究首次将手持拉曼光谱仪引入到抗体药物大分子检测中,为抗体类药物的现场快速鉴别及打假工作提供了新的工具与方法。

分子动力学模拟研究利妥昔单抗国际标准品中人血清白蛋白的活性保护机制

目的研究利妥昔单抗(rituximab)国际标准品中不同比例人血清白蛋白(HSA)作为冻干保护剂对蛋白分子的保护作用及其作用机制。方法使用Gromacs5.0.5工具包,在300 K的温度条件下,运用计算机模拟的方法,搭建模型,分别模拟分析HSA与利妥昔抗原结合片段(Fab)的分子数比分别为1:1、2:1和3:1状态下的分子结构,从结构生物学的角度比较并分析不同比例人血清白蛋白对利妥昔分子的保护机制。结果不同比例的HSA保护剂在一定程度上可以通过与rituximab Fab分子的相互作用来改善蛋白分子表面的亲疏水性质,阻止无规则卷曲结构的形成,从而保护rituximab Fab的天然构象不被破坏,且在1:1、2:1和3:1三种模拟体系中,HSA与rituximab Fab的分子数比例为2:1时保护效果最好。结论当人血清白蛋白与利妥昔Fab的分子数比为2:1保护效果最佳,可为其他单抗标准品的开发提供参考依据。

报告基因法测定重组人白细胞介素-2产品生物学活性的研究

目的:建立测定重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2,rhIL-2)制品生物学活性的报告基因法(reporter gene assay,RGA)。方法:根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》 2020年版指导原则,构建慢病毒转染表达荧光素酶(luciferase,Luc)的C8166细胞,进行rhIL-2生物学活性测定方法学优化与验证,优化内容包括孵育时间、细胞数量、待测样品的初始浓度和稀释比例;验证内容包括特异性、线性和准确性、精密度和耐用性。结果:优化后的检测条件为:孵育时间为24 h;细胞接种密度为1×10~5细胞·孔^(-1);待测样品以10 000 IU·mL^(-1)为起始浓度1∶3稀释10个梯度。荧光信号值强度与待测样品浓度拟合四参数曲线,计算相对效价。选用不同作用类型的细胞因子进行特异性验证均符合应用要求。采用50%,75%,100%,125%和150%的5个浓度点验证线性和部分准确性,实测与理论效价线性回归分析相关系数R~2=0.993 1,各浓度点的回收率均在80%~120%之间。标准品和供试品按5个不同的比例进行混合,测定供试品的加标回收率均在84%~111%之间,均符合质量控制要求。精密度验证主要考察日内和日间精密度及不同人员的重复性,日内、日间的精密度和不同人员之间的重复性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<10%。选取第5,26和78代次的细胞测定荧光信号值,信噪比(S/N)无统计学差异,表明不同代次细胞均可达到检测要求。结论:建立的rhIL-2生物学活性RGA方法适用性强,可应用于质量控制放行检测中。

新型冠状病毒中和抗体生物学活性的测定

目的开发针对新型冠状病毒中和抗体生物学活性及免疫学特性分析的方法。方法使用生物膜层干涉法(biolayer interferometry,BLI)分析9MW3311中和抗体Fab和S1-RBD的亲和力常数;分别使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和流式细胞分选法评价中和抗体结合片段(antibody binding fragment,Fab端)和S蛋白的相对结合活性和对ACE2的阻断结合活性;使用假病毒体系评价中和抗体的体外细胞学活性;使用表面等离子共振法(surface plasmon resonance,SPR)测定抗体Fc段与Fcγ和FcRn受体的亲和力常数;使用ELISA法测定抗体Fc段和C1q受体的结合活性;采用PBMC法确定中和抗体的体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、补体(First subcomponent of the C1 complex)介导的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity,CDC);使用假病毒系统评价中和抗体的依赖性感染增强作用(antibody-dependent enhancement,ADE)效应。结果3批9MW3311中和抗体和参比品与S1-RBD的亲和力常数KD(mol·L^(-1))值分别为1.15×10^(-9),1.01×10^(-9),1.15×10^(-9)和9.45×10^(-10);ELISA和FACS分别测得3批中和抗体相对参比品的结合活性为101%、96%、100%及98%、113%、108%;ELISA和FACS分别测得3批中和抗体相对参比品对ACE2的阻断活性为100%、95%、91%及94%、101%、94%;3批中和抗体相对参比品对假病毒的中和活性分别91%、93%、108%;3批9MW3311中和抗体和参比品分别与FcγR和FcRn均有同等水平的亲和力;9MW3311无ADCC和CDC活性;LALA突变的中和抗体可有效避免ADE效应。结论初步建立了新型冠状病毒中和抗体生物学活性及免疫学特性分析的方法,可用于该类型制品的常规质量控制和放行。

以CD79b为靶点抗体偶联药物的质量研究

目的:建立抗体偶联药物(ADC)抗CD79b单抗-vc-MMAE(维泊妥珠单抗)的质控方法。方法:采用细胞杀伤法测定抗CD79b单抗-vc-MMAE的生物学活性;采用表面等离子共振法(SPR)测定其亲和力参数(K_(D));采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定其与CD79b的相对效价;对抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE进行肽图鉴别;采用分子排阻色谱法(SEC-HPLC)和十二烷基硫酸钠毛细管电泳法(CE-SDS)分析其纯度;采用毛细管等点聚焦电泳法(iCIEF)分析其电荷异质性;采用液质联用法(UPLC-MS)测定其相对分子质量和药物抗体偶联比(DAR);采用疏水色谱法(HIC-HPLC)进一步确认其DAR;采用反相色谱法(RP-HPLC)测定游离小分子药物。结果:抗CD79b单抗-vc-MMAE的生物学活性相对效价为(99.32±3.99)%,K_(D)为(4.27±0.27)×10^(-9)mol·L^(-1),结合活性相对效价为(106.01±2.88)%,抗CD79b单抗和抗CD79b单抗-vc-MMAE的参比品与其样品的肽图图谱一致,SEC-HPLC主峰纯度为(99.32±0.05)%,非还原CE-SDS的重链-重链-轻链-轻链(HHLLC)纯度为(6.89±0.19)%,重链-重链-轻链(HHLC)纯度为(27.21±0.15)%,重链-重链(HHC)纯度为(18.33±0.06)%等,还原CE-SDS轻链和重链纯度为(95.47±0.16)%,iCIEF主峰峰面积百分比为(73.57±0.55)%,主峰等电点7.53±0.00,液质联用法测定抗CD79b单抗-vc-MMAE分别偶联0、2、4、6个小分子药物的相对分子质量为147891、150527、153161和155796,DAR为3.60,HIC法测得的DAR为3.53±0.01,RP-HPLC测定游离小分子药物浓度为(0.039±0.003)μg·mL^(-1)。结论:建立了抗CD79b单抗-vc-MMAE的质控方法,对该产品的安全性、有效性进行控制,为该类ADC药物的质量检测提供参考。

以CD79b为靶点的抗体偶联药物的一级结构表征

目的对基于半胱氨酸偶联方式的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)抗CD79b单抗-vc-MMAE进行一级结构表征。方法本实验采用超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS)对抗CD79b单抗-vc-MMAE的完整相对分子质量、轻重链亚基相对分子质量以及药物抗体偶联比(drug-to-antibody ratio,DAR)进行测定;采用UPLC-MS/MS对抗CD79b单抗-vc-MMAE的序列覆盖度、偶联位点及位点占有率和糖基化位点进行分析,对抗CD79b单抗进行二硫键定位。结果抗CD79b单抗-vc-MMAE的完整相对分子质量包括:ADC药物的未加药形式的相对分子质量为147893、修饰2个小分子药物的相对分子质量为150527、修饰4个小分子药物的相对分子质量为153161以及修饰6个小分子药物的相对分子质量为155796;抗CD79b单抗-vc-MMAE的轻重链亚基相对分子质量包括:轻链的相对分子质量为23726、轻链修饰1个小分子药物的相对分子质量为25043,重链的相对分子质量为48778、重链修饰1个小分子药物的相对分子质量为50095、重链修饰2个小分子药物的相对分子质量为51412、重链修饰3个小分子药物的相对分子质量为52728;抗CD79b单抗-vc-MMAE的DAR为3.60;抗CD79b单抗-vc-MMAE的序列覆盖度为100%;抗CD79b单抗-vc-MMAE的药物偶联位点及位点占有率:轻链C218和重链C220、C226和C229的位点占有率分别为80.46%、80.39%、21.85%以及16.98%。抗CD79b单抗-vc-MMAE的糖基化位点为重链N297;抗CD79b单抗的16对二硫键全部检出。结论表征了抗CD79b单抗-vc-MMAE的一级结构,为该类ADC药物一级结构的研究提供参考依据。

基于报告基因的抗CD52单克隆抗体ADCP生物学活性测定方法的建立

目的建立基于报告基因的抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)生物学活性检测方法。方法(1)以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ转基因细胞系作为效应细胞,通过荧光素酶检测系统(BrightGlo^(TM) luciferase assay system)建立抗CD52单抗的ADCP生物学活性检测方法。(2)对单抗量效范围、效靶比及诱导时间进行优化和方法学验证。(3)将本研究建立的方法应用于对不同抗CD52单抗的ADCP生物学活性检测。结果建立抗CD52单抗的ADCP生物学活性检测方法,抗CD52单抗在该方法中存在量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)^(B)]+D;本方法经优化后确定抗体量效范围为起始工作质量浓度720μg/mL,1∶4倍系列稀释10个稀释度;效靶比为1∶2,诱导时间为20 h;本方法经方法学验证,具有良好的专属性;5个不同稀释组回收率样品经3次测定,相对效价分别为(52.81±5.61)%、(83.66±8.48)%、(100.45±2.65)%、(140.89±8.26)%和(155.10±13.23)%;对应的回收率分别为(105.61±11.22)%、(111.54±11.31)%、(100.45±2.65)%、(112.71±6.61)%和(103.40±8.82)%,上述结果的变异系数(coefficient of variation,CV)均<11%;且该方法也适用于不同抗CD52单抗的ADCP效应评价。结论利用转基因细胞法成功建立了抗CD52单抗ADCP生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD52单抗的ADCP生物学活性。

重组人1型单纯疱疹病毒样品的活性检测研究

目的:建立分析重组人1型单纯疱疹病毒(r HSV-1)样品感染滴度和生物学活性的方法。方法:采用噬斑法检测重组人1型单纯疱疹病毒的感染滴度,采用选择性增殖活性检测法和肿瘤细胞杀伤活性检测法检测样品的生物学活性,分别对上述方法进行重复性和精密度性能验证,并用上述方法对6批样品中的感染滴度和生物学活性进行检测。结果:经验证,上述3种方法均有较好的重复性和精密度,精密度RSD分别为5.3%、3.9%和19.4%;6批测试样品中,感染滴度为(3.06±0.37)×10^7 PFU·mL^-1,选择性增殖活性为(1.58±0.63)×10^5,肿瘤细胞杀伤活性为0.0278±0.0159。结论:经方法学验证,噬斑法、选择性增殖活性检测法和肿瘤细胞杀伤活性检测法可分别用于重组人1型单纯疱疹病毒的感染滴度和生物学活性的检测。

抗表皮生长因子受体单克隆抗体部分质量控制项目的趋势分析

在过去的30年,单克隆抗体已从科学工具转变为应用广泛的临床疗法[1],现广泛应用于恶性肿瘤、移植排斥、自身免疫性和传染性疾病等一系列疾病的治疗[2]。新单克隆抗体药物以每年近40种的速度进入临床研究[3],已成为近年来复合增长率较快的一类生物技术药物,约占现有生物制药研发35%[4],截至2017年初,全球有52种单克隆抗体进入Ⅲ期临床研究,超过230种单克隆抗体在Ⅱ期临床研究中[5]用于癌症治疗取得了相当大的成功[6]。基于分子水平的肿瘤靶向疗法为癌症患者提供了新的治疗机会[7],生长因子受体系统和血管生成已成为重要的治疗靶点,其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)一直是人们关注的焦点[8-11]。

抗EpCAM+CD3双特异性抗体关键表征解析

目的:解析抗EpCAM+CD3双特异性抗体(BsAb)的关键表征。方法:以抗EpCAM+CD3双特异性抗体为研究对象,超高效液相色谱串联质谱联用技术(LC-MS/MS)检测相对分子质量、肽图(氨基酸序列)、N-糖基化位点、糖型及各糖型含量、二硫键位点;表面等离子体共振(SPR)技术测定其与上皮细胞粘附因子(EpCAM)、白细胞分化簇3(CD3)和Fc受体(FcRs)的亲和力。结果:含糖基化的完整抗体、轻链、重链和单链的相对分子质量分别为128521.78、24117.83、50808.85和53585.87;不含糖完整抗体、轻链、重链和单链的相对分子质量分别为125633.30、24117.85、49364.53和52141.30;对象BsAb氨基酸序列与理论序列一致;N-糖基化位点位于重链Asn300和单链Asn326;N-连接寡糖的糖型包括以岩藻糖化的双天线复杂N-糖(G0F占全部糖型含量77.10%)为主的11种糖型;对象BsAb内含13对二硫键;单链第Cys105位和第Cys249为游离巯基;SPR测定结果显示:对象BsAb与EpCAM、CD3的亲和力分别为2.71×10^-8和5.94×10^-7 mol·L^-1,与FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅡb、FcγRⅢa、FcγRⅢb和FcRn的亲和力分别为2.89×10^-8、8.85×10^-7、7.94×10^-6、3.69×10^-7、2.73×10^-6和8.77×10^-7 mol·L^-1。结论:采用LC-MS/MS和SPR技术可有效解析抗EpCAM+CD3 BsAb的关键表征,为其质量控制和产品放行提供依据。

抗EpCAM+CD3双特异性抗体细胞生物学活性报告基因测定方法的建立和验证

目的:建立基于细胞的抗EpCAM+CD3双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)生物学活性报告基因测定方法(reporter gene assay,RGA)。方法:构建稳定表达萤光素酶(luciferase,Luc)的HcT116-Luc细胞为靶细胞,以Hu T78细胞为效应细胞,通过对样品浓度、孵育时间、细胞接种时间、效靶比和细胞接种密度进行优化建立报告基因法,根据人用药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)Q2指导原则和《中华人民共和国药典》(2015)指导原则,对RGA法的特异性、准确性、精密度、线性、代次稳定性和耐用性进行验证。结果:建立RGA方法经优化后的检测条件:效靶比为10∶1;细胞接种密度为1.1×10^(4)细胞·孔^(-1);Bs Ab样品以3000 ng·mL^(-1)为起始浓度1∶3.5向下稀释9个浓度梯度(共10个检测浓度);系列稀释样品与细胞孵育时间为72 h。孵育结束后测定Luc强度并以4-参数模式拟合剂量-效应曲线,计算样品相对生物学活性。建立RGA法的特异性、耐用性均符合应用要求。采用50%,70%,80%,100%,120%,130%,150%和200%共8个效价浓度进行准确性、精密度和线性验证,8个效价浓度的生物学活性回收率在95.48%~107.37%,变异系数(coefficient of variation,CV)在4.80%~9.97%,均<10%,实测效价与理论效价线性回归分析相关系数r^(2)>0.99。第14~33代次HcT116-Luc细胞Luc表达情况稳定。结论:基于传代细胞建立的抗EpCAM+CD3 Bs Ab报告基因生物学活性测定方法操作简便,其特异性、精密度、准确性、耐用性方面符合应用要求,可作为此类双特异性抗体活性评价的方法,用于其质量控制中。

人白细胞分化抗原19蛋白结构与功能的生物信息学分析

目的运用生物信息学方法对人白细胞分化抗原19(B-lymphocyte antigen CD19,以下简称CD19)蛋白的理化性质、空间结构、蛋白质的修饰位点以及相互作用网络进行分析。方法从蛋白质数据库(Universal Protein, UniProt)获取人CD19蛋白的序列信息,并运用ExPASy、SignalP 5.0 Server、TMHMMServer v.2.0、SOPMA、SWISS-MODEL、UniProt数据库、STRING、Pymol等对人CD19蛋白进行全面、系统的分析。结果软件预测及已经解析的结构显示,人CD19蛋白由信号肽、胞外域、跨膜域及胞内域组成,其胞外域结构主要由β折叠片组成,跨膜域由一段α螺旋组成,已报道的磷酸化位点有6个,N糖基化位点有5个。与人CD19蛋白形成蛋白网络的蛋白有10个,分别是CD79A、CR2、LYN、CD79B、CD81、SYK、VAV1、BTK、BCL6和IGLL5。人CD19蛋白参与的信号通路有B细胞受体信号通路、Fc epsilon RI信号通路等,此外,还参与原发性免疫缺陷以及EB病毒感染等。结论经过软件分析及结构预测分析,阐述了人CD19蛋白的结构与功能的关系,为免疫治疗药物的开发提供参考依据。