三种常用非甾体类抗炎滴眼液对人角膜上皮细胞的毒性研究

背景 双氯芬酸钠滴眼液、普拉洛芬滴眼液和溴芬酸钠滴眼液是眼科临床常用的非甾体类抗炎药（NSAIDs）,长期应用可导致人角膜上皮细胞（HCECs）的损伤,但3种滴眼液导致HCECs的损伤程度及滴眼液中添加物的细胞毒性尚不清楚. 目的 评价双氯芬酸钠滴眼液、普拉洛芬滴眼液和溴芬酸钠滴眼液及其相应原料药对HCECs的毒性,明确其细胞毒性的主要来源. 方法 常规培养HCECs,分别在培养液中添加1∶1、1∶2、1∶5、1∶10稀释的滴眼液或原料药,使最终质量分数分别为0.10％、0.05％、0.02％和0.01％.采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组药物处理后HCECs的增生率;3种滴眼液均稀释至质量浓度0.002％（1∶50）,以Transwell法检测各组药物处理后HCECs迁移率;采用乳酸脱氢酶（LDH）检测法测定各组药物处理后HCECs损伤程度.结果 3种滴眼液对HCECs的毒性作用具有剂量依赖性,差异均有统计学意义（均P=0.00）,其中双氯芬酸钠滴眼液对HCECs增生、迁移和损伤影响最大,溴芬酸钠滴眼液对HCECs损伤程度最小,差异均有统计学意义（增生：F药物=20.25,P=0.00;迁移：F=103.43,P=0.00;损伤：F药物=164.16,P=0.00）.与滴眼液相比,原料药的细胞毒性作用普遍较小,其中普拉洛芬原料药对HCECs增生、迁移和损伤影响最小,差异均有统计学意义（增生：F药物=332.27,P=0.00;迁移：F=23.02,P=0.00;损伤：F药物=154.83,P=0.00）. 结论 双氯芬酸钠滴眼液、普拉洛芬滴眼液和溴芬酸钠滴眼液中以双氯芬酸钠对角膜上皮的毒性作用最大;3种药物的细胞毒性来源是添加物本身或原料药与添加物综合作用的结果.

ROCK抑制剂Y-27632在角膜保存时对角膜缘干细胞活性的促进作用

背景 角膜缘干细胞（LSCs）对维持角膜上皮的稳定和角膜组织透明性有重要作用.Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632能够促进人胚胎干细胞、角质上皮细胞等的增生,减少细胞凋亡.目的 探讨Y-27632对离体兔角膜保存和体外LSCs扩增能力的影响. 方法 在细胞培养基MEM中加入质量分数12.5％硫酸软骨素、质量分数10.0％低分子右旋糖酐、20.0 mg/L地塞米松、100 mg/L妥布霉素注射液、9.5 g/L Hepes,使用时添加0.375 mg/L L-谷氨酰胺,制备成角膜活性保存液.将新西兰大白兔的角膜组织片分别置于含或不含Y-27632的角膜活性保存液中保存4、7、14d,采用质量分数0.25％锥虫蓝和质量分数0.2％茜素红染色法观察角膜内皮细胞密度及形态,采用Giemsa染色法并使用Image J图像分析软件计数克隆球数量和LSCs活性,计算LSCs存活率和克隆形成效率. 结果 角膜片保存4d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞形态无明显差别,角膜片保存7d时,Y-27632保存液组角膜内皮细胞形态仍保持规则的六边形,而单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞的细胞膜轻微皱缩,少数细胞体积变大.角膜片保存14 d时单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞可见较多的茜素红斑.单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞计数为（2 262±75）/mm2,Y-27632保存液组角膜内皮细胞计数为（2 425 ±95）/mm2,差异有统计学意义（P＜0.001）.新鲜角膜片和角膜片保存4d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆球均较大,其内细胞数较多,而保存7d和14 d时,与Y-27632保存液组比较,单纯角膜中期保存液组LSCs克隆球直径明显缩小.新鲜分离的角膜片和角膜片保存4d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成率和角膜上皮细胞存活率的差异均无统计学意义（均P＞0.05）;角膜片保存7d和14d时,角膜缘上皮细胞的活性率分别为（73.00±2.12）％和（56.00±0.71）％,明显高于单纯角膜中期培养液组的（66.00±4.00）％和（49.00±0.71）％,差异均有统计学意义（t=3.098,P=0.018;t=9.798,P=0.000）;角膜片保存7d和14 d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成效率分别为（11.05±0.21）％和（3.10±1.97）％,明显高于单纯角膜中期保存液组中的（2.05±1.20）％和（0.40±0.14）％,差异均有统计学意义（t=18.107,P=0.000;t=3.184,P=0.017）.结论角膜保存液中添加Y-27632可明显提高离体角膜保存的效果,同时可维持LSCs的活性及克隆形成能力.Y-27632可作为角膜保存液的有效添加成分。

蒙脱石盐酸倍他洛尔固体脂质纳米粒的制备及理化性质考察

目的制备治疗青光眼的蒙脱石盐酸倍他洛尔固体脂质纳米粒(MMT-BH-SLN),并考察其理化性质。方法采用乳化蒸发-低温固化法制备MMT-BH-SLN,建立正交实验,以包封率为评价指标,筛选最优制备工艺。采用透析法考察体外释药特性,通过细胞毒(MTT)实验评价药物体外细胞毒性。结果制备MMT-BH-SLN的最优处方为:药物30mg,单硬脂酸甘油酯30mg,卵磷脂100mg,质量浓度为36g·L-1的甘露醇溶液25mL,内水相的质量浓度为2g·L-1。平均包封率为81.81%±0.48%,载药量为4.85%±0.21%。MMT-BH-SLN可连续释放12h且药物累积释放百分率达85%。相比盐酸倍他洛尔水溶液,MMT-BH-SLN对人永生化角膜上皮细胞的毒性较小。结论采用乳化蒸发-低温固化法制备MMT-BH-SLN,缓释性能良好,包封率和载药能力较高,细胞毒性小。

尼克酰胺对人胚胎干细胞向神经嵴细胞分化的诱导作用

目的探讨尼克酰胺(NIC)在人胚胎干细胞(hESCs)诱导分化为神经嵴细胞过程中的作用,为hESCs进一步分化为角膜内皮细胞提供实验基础。方法取培养5~7 d的hESCs细胞系H1进行诱导,根据诱导培养基中干预组分的不同分为未添加NIC组(仅使用诱导培养基)、NIC添加组(含10 mmol/L NIC的诱导培养基)、NIC+白藜芦醇(Res)组(含10 mmol/L NIC、10μmol/L Res的诱导培养基)和Sirtinol组(含10μmol/L Sirtinol的诱导培养基),其中Res和Sirtinol分别为SIRT1活性激动剂和抑制剂,各组连续诱导7 d。采用实时荧光定量PCR法检测诱导1、3、5、7 d hESCs及神经嵴细胞标志物mRNA相对表达量;诱导后7 d,采用免疫荧光染色法测定hESCs来源神经嵴细胞相关标志蛋白的表达,采用流式细胞术分析hESCs来源神经嵴细胞表面标志物神经生长因子受体(P75)和人自然杀伤因子1(HNK-1)阳性细胞比率,以评价NIC诱导效率及调控SIRT1对HNK-1^(+)表达的影响。结果与未添加NIC组相比,NIC添加组处理5 d后全能性基因八聚体结合转录因子4(OCT4)和同源域蛋白(NANOG)mRNA相对表达量显著降低,神经嵴细胞标志物P75、HNK-1、SRY相关HMG盒9(SOX9)和SOX10 mRNA相对表达量升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,未添加NIC组神经嵴细胞标志物P75表达较弱,HNK-1仅有零星表达,转录因子激活蛋白2β(AP-2β)及成对样同源域转录因子2(PITX2)均未见阳性着色;NIC添加组细胞中P75、HNK-1、AP-2β及PITX2均呈广泛的强阳性表达。NIC添加组P75+HNK-1+和P75+细胞比率高于未添加NIC组,差异均有统计学意义(t=8.481,P=0.001;t=2.987,P=0.041)。未添加NIC组、NIC添加组、NIC+Res组和Sirtinol组HNK-1^(+)细胞比率分别为(34.267±12.522)%、(89.633±1.358)%、(64.667±6.429)%和(86.300±3.460)%,总体比较差异有统计学意义(F=36.799,P<0.001),其中,NIC+Res组HNK-1^(+)细胞比率均低于NIC添加组和Sirtinol组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论NIC可通过抑制SIRT1的活性促进HNK-1表达,提高hESCs来源神经嵴细胞的分化效率,为神经嵴细胞相关疾病的治疗,如角膜内皮移植提供新的种子细胞来源。

体外培养的同种异体角膜缘上皮细胞移植治疗多种大范围结膜病变的疗效观察

目的 探讨结膜病灶切除联合体外培养的同种异体角膜缘上皮细胞移植治疗多种大范围结膜病变的治疗效果.方法 回顾性分析自2013年1月至2015年12月在青岛眼科医院行体外培养的同种异体角膜缘上皮细胞移植治疗大范围结膜病变患者11例（12只眼）的治疗效果.患者平均年龄（46±23）岁,男性5例,女性6例.平均随访时间（24.8±12.4）个月.手术方法：取新鲜供体角膜缘上皮组织进行细胞消化分离,将细胞置于去上皮的羊膜上培养生长,使其形成3～5层复层的细胞膜片备用.切除结膜病灶,取与结膜缺损相应大小的角膜缘上皮细胞膜片覆盖于巩膜裸露处,对位缝合结膜与角膜缘上皮细胞膜片,术后7d拆线.记录所有患者的病变累计范围、手术效果、病理学检查结果、术后并发症等情况.结果 11例（12只眼）患者中合并睑球粘连的复发性翼状胬肉6例（6只眼）,结膜复合痣3例（3只眼）,结膜原发性获得性黑变病1例（1只眼）,巨大皮样脂肪瘤1例（2只眼）.所有患者的结膜病变累及范围均超过2个象限.所有患者均无术中、术后并发症发生.术后无明显的刺激症状.由于手术操作的损伤,手术结束时,角膜缘上皮细胞膜片上会有少量小片状上皮缺损,随着术后细胞的增殖修复,上皮会逐渐愈合并趋于牢固,且与自体结膜上皮的界限逐渐消失.术后上皮的愈合时间为3～7 d,平均（4.5±1.2）d.术后未观察到免疫排斥反应发生.所有患者末次随访时均未观察到原发病复发情况.结论 体外培养的同种异体角膜缘上皮细胞移植治疗大范围的结膜病变可使病变切除区域迅速上皮化,可降低原发病复发几率,有效避免术后睑球粘连的发生,术后炎性反应轻,可获得良好的效果.

盐酸倍他洛尔-蒙脱石脂质体的制备与性能考察

目的:优化盐酸倍他洛尔-蒙脱石脂质体(Mt-BH-LP)的处方及制备工艺,考察其体外释放性能和渗透性能。方法:采用乙醇注入法-硫酸铵梯度法制备Mt-BH-LP;以包封率和载药量为评价指标,采用正交试验优化Mt-BH-LP的处方;通过透析法考察Mt-BH-LP的体外释放性能;以家兔离体角膜为模型,采用体外改良的Franz扩散池法研究Mt-BH-LP的渗透性,以人永生化角膜上皮细胞(i HCEC)为模型,研究Mt-BH-LP的渗透性。结果:Mt-BH-LP处方工艺条件为卵磷脂-BH(5∶1),卵磷脂-胆固醇(9∶1),硫酸铵浓度0.15 mol·L^(-1),卵磷脂质量225 mg。Mt-BH-LP包封率(75.85±2.15)%,载药量(11.41±0.29)%,平均粒径(218±22.32)nm,Zeta电位(17.03±0.25)m V;体外释放试验表明Mt-BH-LP在10 h累计释放度达到60.2%,离体角膜透过试验结果表明Mt-BH-LP的角膜水化值[(76.72±2.68)%]在正常范围内。结论:采用乙醇注入法-硫酸铵梯度法制备的Mt-BH-LP包封率和载药量较高,缓释性能良好,具有良好的开发与应用前景。