布鲁菌BMEI1829基因的原核表达、蛋白纯化及动物免疫试验

利用PSORTb及CELLO生物学软件对布鲁菌16M菌株基因组序列进行分析,预测其外膜蛋白基因序列;选取BMEI1829基因进行PCR扩增并与原核表达载体pET32a(+)连接,转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞;IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定目的蛋白的表达;经His-TrapTMHP纯化,免疫Balb/c小鼠,间接ELISA法检测特异性抗体。结果表明,BMEI1829蛋白在原核表达系统中成功表达,纯化后蛋白免疫Balb/c小鼠可产生特异性抗体,抗体亚型分布以IgG1、IgG2b为主,为进一步研究其功能奠定了基础。

6个布鲁氏菌蛋白的克隆、表达及纯化

目的构建含6个布鲁氏菌蛋白的原核表达载体,并对其重组蛋白进行诱导表达及纯化。方法以羊种布鲁氏菌16M基因组DNA为模板扩增6个蛋白基因,与载体pET32a(+)连接,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定,采用HisTrapTMHP纯化目的蛋白。结果成功克隆了6个布鲁氏菌蛋白,经对表达条件进行优化,目的蛋白获得大量表达,纯化后纯度达90%以上。结论获得了纯度较高的6个布鲁氏菌蛋白,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定基础。

CVA10候选疫苗病毒株的分离、鉴定及其致病性和免疫保护性研究

目的分离、筛选柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CVA10)病毒候选疫苗株,并对其免疫原性及免疫保护性进行评价,为CVA10疫苗的研制奠定基础。方法本研究从北京市儿童医院、军事医学研究院、北京市疾控中心共收集80个手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)标本,通过细胞培养法、RT-PCR的方法分离、鉴定CVA10病毒株。对病毒进行嗜斑纯化,各纯化病毒株与Al(OH)3(0.5 g/ml)佐剂混合后制备原疫苗,免疫Balb/c小鼠,收集血清。应用交叉中和实验及抗体阳转率实验筛选候选CVA10疫苗株。筛选后T9疫苗株免疫ICR乳鼠,观察ICR乳鼠的致病情况。结果共分离出14株CVA10病毒株。交叉中和实验筛选得到4株候选疫苗株。最后阳转率实验确定T9为候选疫苗株。Al(OH)3+CVA10灭活抗原在Balb/c小鼠体内能诱生高滴度的特异性抗体,该抗体对Balb/c小鼠有保护作用。T9病毒免疫ICR乳鼠后,对乳鼠完全致死。结论筛选1株CVA10病毒候选疫苗株,CVA10候选疫苗对ICR乳鼠动物模型有致病性。

手足口病CA16型VP1亚单位疫苗的构建制备及免疫原性初步分析

目的制备CA16型VP1蛋白疫苗并进行免疫原性初步分析，为手足VI病CA16疫苗的深入研究提供资料。方法利用RT—PCR技术获得CA16VP1基因，克隆到载体pFastBacHTA，与BacmidDNA重组，转染Si9昆虫细胞，重组CA16VP1蛋白与AI（OH），佐剂混合制备重组CA16VP1蛋白疫苗，腹腔免疫BALB／c小鼠，2次免疫后进行免疫效果初步评价。结果用间接免疫荧光、SDS—PAGE和Westernblot法，证明重组CA16VP1蛋白在昆虫细胞St9中得到表达，用ELISA和微量中和法检测到免疫小鼠血清有特异IgG和中和抗体产生，最佳免疫抗原剂量为20μg，其特异IgG效价为1：1600，中和抗体效价为1：250；通过淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定，证明诱导T细胞应答，诱发Th1／Th2型免疫应答。结论CA16VP1基因克隆成功，并在Sf9昆虫细胞中获得表达，构建的重组CA16VP1亚单位疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力，为今后研制手足口病CA16疫苗奠定了基础。