酵母表达系统制备的猪圆环亚单位疫苗效果评估

猪圆环病毒目前仍然是危害养猪业的重要病原,接种疫苗是目前最有效的预防措施,采用昆虫-杆状病毒或大肠杆菌系统表达制备的猪圆环亚单位疫苗已经在临床上推广使用,免疫效果良好。酵母表达系统因具有成本低、易培养、无内毒素等优势,理论上更适合用于动物疫苗的开发。笔者利用国内自主知识产权的马克斯克鲁维酵母(KM)系统表达猪圆环cap蛋白,蛋白表达水平可达到2g/L;通过对生产工艺的不断优化,可获得高纯度的cap蛋白,且均能自我组装形成VLP。酵母源圆环亚单位疫苗免疫猪后,产生的抗体滴度高于进口的圆环亚单位疫苗,且安全性良好,免疫猪未出现任何不良反应。

鸭圆环病毒无核定位信号衣壳蛋白的原核表达及其在间接ELISA中的应用

鸭圆环病毒(DuCV)是一种具有长期免疫抑制特性的病原体,其Cap蛋白是DuCV的主要结构蛋白和主要免疫保护抗原,构成病毒的核衣壳,对DuCV的血清学诊断具有重要意义。为了开发出适合DuCV的检测方法,本研究在重组Rosetta大肠杆菌细胞内对无核定位信号的DuCV Cap蛋白进行了表达,建立了基于无核定位信号Cap蛋白检测DuCV血清抗体的间接ELISA方法(Cap-ELISA)。结果:Cap-ELISA包被抗原的最佳浓度为280 ng/孔,血清稀释比为1∶1600;检测样本的阴阳临界值为0.339,灵敏度达到1∶12800,并对DuCV抗体检测具有特异性;与常规PCR方法的符合率为92.7%,用Cap-ELISA对山东部分地区的樱桃谷鸭血清进行了间接ELISA检测,总阳性率为88.9%,说明该方法适合在DuCV血清学诊断中应用。

鸭腺病毒3型Fiber-2蛋白在酵母细胞中的表达及免疫原性研究

[目的]利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)系统高效表达鸭腺病毒3型(DAdV-3)Fiber-2蛋白,用于制备安全、高效、低成本的鸭腺病毒亚单位疫苗。[方法]以食品安全级的马克斯克鲁维酵母为宿主,对DAdV-3 Fiber-2蛋白进行重组表达,建立高密度发酵和纯化工艺,获得目的蛋白并制备成亚单位疫苗,然后进行动物试验。试验分为低剂量组(琼扩效价1∶64,每羽34μg)、高剂量组(1∶128,每羽68μg)、空白组和攻毒对照组,在免疫后第10天和第21天采血检测血清中的抗体水平,攻毒7 d后采肛拭子检测排毒量;通过抗体水平和排毒量评估该亚单位疫苗的保护效果。[结果]通过SDS-PAGE、Western blot和琼脂糖凝胶扩散(AGP)试验验证fiber-2基因在酵母中成功表达。重组菌经高密度发酵,目的蛋白纯化后检测其表达水平,琼扩效价可达1∶128。动物试验结果显示,疫苗免疫组在免疫后第21天所测得血清中的抗体水平显著高于空白组;疫苗免疫组在攻毒7 d后的排毒量显著低于攻毒对照组。[结论]DAdV-3 Fiber-2蛋白能在马克斯克鲁维酵母细胞中进行高效表达,并且用该蛋白制备的亚单位疫苗对鸭3型腺病毒具有一定的保护作用。

猪氨肽酶N基因的克隆、表达系统构建和鉴定

为探讨猪氨肽酶N(APN)作为产肠毒素性大肠杆菌F4ac的受体蛋白的可能性,根据GenBank上的猪APN mRNA序列设计合成特异性引物,从新鲜的猪小肠组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增猪APN全长基因,并分别构建真核表达和原核表达系统。结果表明:APN基因已正确插入pcDNA3.1真核表达载体和pET-28a(+)原核表达载体,SDS-PAGE结果证明重组蛋白为包涵体,且纯化产物在110ku处有单一明显条带。pcDNA3.1-APN和pET28a-TAPN双系统的成功构建以及APN蛋白的成功表达,为进一步研究和验证该蛋白作为猪F4ac受体候选蛋白的可能性奠定基础。

鹅细小病毒鹅胚化疫苗株SYG61v对雏鹅毒力减弱的遗传基础分析

本研究对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)SYG61v弱毒疫苗株与5个分离于不同年代的GPV强毒株,在编码蛋白氨基酸序列及非编码调控区碱基序列进行了比对,确定了SYG61v的特征性突变位点,而5个强毒株中这些位点均高度保守。SYG61v株的VP1和Rep1蛋白,分别产生了11个和10个氨基酸位点突变。Rep1的10个突变氨基酸中,7个均处于Rep1蛋白羧基端的100个氨基酸范围内,而VP1蛋白中的10个突变氨基酸中,推测仅有1个位点处于病毒衣壳表面。在左侧末端倒置重复序列(inverted terminal repeat,ITR)与P9启动子之间非编码区,存在两段共7个碱基的连续碱基突变。SYG61v弱毒株中突变位点的确认为进一步明确他们各自在弱毒株毒力减弱中的作用奠定了基础。

肠炎沙门菌Ⅰ型菌毛主要亚单位FimA原核表达及纯化

为探讨肠炎沙门菌非编码小RNA(non-coding small RNA)IsrE在转录后水平是否参与对fimA的调控作用,在大肠杆菌中构建并表达FimA重组蛋白,并对其培养条件进行优化,制备高纯度FimA重组蛋白。利用原核表达载体p ET-28a(+)构建出能表达fimA的重组质粒,并分别对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间等条件进行优化,以提高目的蛋白的产量和增大其可溶性,最后经Ni-NTA亲和层析分离纯化FimA重组蛋白。通过酶切、测序和Western blot鉴定分析,成功构建并表达肠炎沙门菌I型菌毛主要亚单位FimA,蛋白分子质量约为19.3 kDa,且主要以包涵体的形式表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE中显示单一条带。本研究构建、表达并获得纯度较高的重组蛋白FimA,为进一步研究和验证肠炎沙门菌非编码sRNA IsrE是否在转录后水平参与对fimA的调控奠定了基础。

鹅细小病毒强毒株YZ99-6感染性质粒的构建及其在鹅胚中的拯救

为构建鹅细小病毒(GPV)强毒株YZ99-6的感染性质粒,本研究在分段克隆GPV YZ99-6株的亚基因组片段基础上,通过拼接将GPV全基因组克隆于p Bluescript II(SK)载体中,构建重组质粒p YZ。将引入遗传标记的重组质粒p YZ通过绒毛尿囊膜转染11日龄鹅胚,结果显示能够拯救出感染性病毒。序列测定表明除了作为遗传标记引入的碱基点突变外,拯救病毒的基因组序列与其亲本株YZ99-6完全一致。雏鹅感染试验显示拯救病毒具有与其亲本病毒相近的致病性。本研究建立的YZ99-6强毒株感染性质粒为研究GPV的致病机理奠定了基础。

犬细小病毒病毒样颗粒在马克斯克鲁维酵母中的表达及免疫原性研究

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种急性、高度接触性传染病,是目前影响犬类健康的最严重的传染病之一.疫苗免疫是预防并控制CPV传播的重要措施.本研究以马克斯克鲁维酵母作为表达宿主进行犬细小病毒VP2蛋白的重组表达.犬细小病毒VP2蛋白经密码子优化后,在马克斯克鲁维酵母中获得高效表达,表达量可达到2.4g/L.重组表达的VP2蛋白自我组装形成大小为20nm的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),经分子筛凝胶层析纯化的VLPs制成疫苗,注射免疫小鼠进49天后抗体滴度可达10 000以上,并诱导小鼠产生血凝抑制抗体,表明利用马克斯克鲁维酵母制备的VLPs疫苗具有较高的免疫原性.

CSFV E2蛋白主要抗原区域在马克斯克鲁维酵母中的表达及小鼠免疫

猪瘟是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度接触传染性和致死性疾病.疫苗预防接种是控制猪瘟病毒传播的重要措施,目前我国使用的弱毒疫苗均为1.1亚型猪瘟病毒兔化弱毒株.随着病毒的不断变异,2.1亚型猪瘟病毒已经逐渐成为我国的主要流行毒株.本研究利用马克斯克鲁维酵母研究了2.1b型CSFV E2蛋白及其截短体mE2(690-916aa)在马克斯克鲁维酵母中的重组表达,发现去除E2蛋白跨膜区域可以显著提高E2蛋白表达水平,mE2的表达量在5L发酵罐中达1.25～2.5g/L.经分子筛纯化,mE2蛋白纯度达90%.纯化的mE2作为抗原蛋白,注射免疫小鼠28d后,可诱导小鼠产生抗CSFV的IgG特异性抗体,表明马克斯克鲁维酵母重组表达的mE2蛋白具有较好的免疫原性.

鹅细小病毒Rep1蛋白的原核表达及抗体制备

为深入研究鹅细小病毒(GPV)Rep蛋白的功能,采用PCR方法扩增出完整的Rep1基因,并克隆入原核表达载体pET-28a(+)。将重组质粒pET28-Rep1导入到大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE分析表明:37℃下经1mmol·L^(-1) IPTG诱导4h,Rep1蛋白可获得高效表达。重组蛋白经切胶免疫BALB/c小鼠制备针对Rep1蛋白的多克隆抗体。经间接免疫荧光检测,1∶1 000稀释的多抗能特异性识别在鹅胚成纤维细胞上增殖的GPV抗原,说明所制备的多抗具有良好反应原性,可用于后续针对Rep蛋白的相关功能研究。

鹅细小病毒VP1蛋白氨基酸点突变在鹅胚化疫苗株毒力减弱中的关键作用

为了进一步明确各编码蛋白基因在鹅细小病毒（gooseparvovirus）鹅胚化疫苗株毒力减弱中的作用，以先前构建的弱毒疫苗株感染性质粒pSYG61v和强毒株感染性质粒pLH为基础，通过重叠PCR方法，在pSYG61v和pLH质粒之间互换Rep1和VP1基因片段，获得了6个嵌舍质粒pSYG-vRepl、pSYG-vVPl、pSYG-vRC、pLH-aRepl、pLH-aVP1和pLH-aRC。将质粒以绒毛尿囊膜途径转染11日龄鹅胚分别拯救出嵌合病毒。嵌合病毒的雏鹅攻毒试验表明，携带强毒株VP1基因的psYGvRC、pSYG-vVP1和pLH—aRepl这3个嵌合病毒对雏鹅表现出明显致病性，死亡率在75．0％-82．5％。完全携带弱毒株rep-cap编码框的pLH-aRC嵌合病毒攻毒组雏鹅无一死亡。携带强毒株Repl基因的pLH—aVP1和psYpvRep1嵌合病毒攻毒组雏鹅也无一死亡，但在试验期内部分雏鹅明显生长迟缓。嵌合病毒攻毒试验结果表明，结构蛋白VP1基因的氨基酸点突变对GPV鹅胚化疫苗株的毒力减弱起着关键作用。

国内部分地区猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测及高致病性毒株的分离与毒力鉴定

为了解国内部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况,采用国标RT-PCR方法,对2017至2019年间来自全国14个省(市)的不同规模化猪场的1441份病料进行了PRRSV检测,并对分离到的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株进行了分子特性和致病特性研究。结果表明,猪场PRRSV阳性率为22.14%,其中HP-PRRSV占到了阳性样品的49.84%;筛选部分病料分别接种猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,成功分离到1株病毒,经电镜观察和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定为PRRSV,并命名为RP19。对RP19毒株nsp2和ORF5基因序列分析表明,RP19与高致病性毒株TJ的序列相似度最高,并且其nsp2基因编码区含有特征性的(29+1)个氨基酸缺失。以10^(5.0) TCID_(50)/mL的攻毒剂量在5周龄的仔猪上进行动物回归试验。结果显示,与对照组相比,RP19的攻毒组仔猪的日增重显著减少,体温升高,出现咳嗽、身体颤抖以及后肢麻痹等严重的临床症状,且有1头仔猪出现死亡,说明RP19有较强毒力。病理组织学结果显示,病猪肺脏呈现PRRSV感染造成的典型弥漫性间质性肺炎症状。本研究调查了近年来PRRSV在我国14省(市)的流行情况,并分离到1株高致病性毒株,为PRRS的预防和疫苗制备提供了依据。