黄花香茶菜甲素靶向ETS1诱导乳腺癌细胞铁死亡的作用机制

目的:探讨从黄花香茶菜中提取的新型二萜化合物黄花香茶菜甲素(Sculponeatin A,stA)诱导乳腺癌铁死亡的作用机制。方法:使用实时无标记细胞分析技术、克隆形成实验和共聚焦高内涵成像分析评估stA对乳腺癌细胞增殖的影响;利用活性氧检测试剂盒和流式细胞术,以及谷胱甘肽检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒、亚铁离子检测试剂盒等探究stA对乳腺癌细胞铁死亡的影响;利用Western blot检测stA对铁死亡上游调控因子ETS1(E26 transformation specific 1)蛋白表达的作用;通过分子对接,微量热泳动实验以及基于靶点稳定性的药物亲和反应检测stA与ETS1的结合作用。结果:stA在纳摩尔级剂量下抑制乳腺癌细胞的生长,并改变细胞的形态;stA能够诱导乳腺癌细胞铁死亡;stA通过下调ETS1的蛋白表达来诱导乳腺癌细胞发生铁死亡;stA与ETS1有直接结合能力。结论:stA能够直接结合ETS1,通过下调ETS1表达而诱导乳腺癌xCT途径铁死亡。

乙氧基二氢血根碱靶向EGFR抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为并诱导凋亡的机制研究

目的 探讨乙氧基二氢血根碱(ethoxydihydrosanguinarine, ESG)对结直肠癌细胞的抑制及具体分子机制。方法 选用结直肠癌细胞系RKO和HRT-18。实验分为空白对照组和加药组(1.0、1.5、2.0μmol/L ESG)。通过CCK-8法、实时无标记细胞分析技术(real time cellular analysis, RTCA)及克隆形成实验检测ESG对细胞增殖能力的影响;以流式细胞术、DAPI染色、JC-1线粒体膜电位和活性氧检测试剂盒检测ESG对细胞凋亡的影响;通过高内涵成像分析技术及Transwell侵袭实验检测ESG对细胞侵袭、迁移的影响;Western blot检测细胞凋亡及侵袭、迁移相关蛋白的表达,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)以及下游Akt/ERK信号通路蛋白的表达及磷酸化水平;通过过表达EGFR和敲低EGFR探讨EGFR在ESG诱导结直肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖及侵袭迁移过程中的作用;通过分子对接、靶点稳定性药物亲和反应实验以及微量热泳动实验检测ESG与EGFR的直接结合作用。结果 ESG显著抑制结直肠癌细胞的增殖及克隆形成能力;ESG诱导结直肠癌细胞发生线粒体途径凋亡并抑制其侵袭、迁移能力;ESG直接结合EGFR的激酶活性区而抑制其活性,进而下调其下游与肿瘤恶性进展相关的信号分子Akt、ERK的磷酸化水平。结论 ESG靶向结合并抑制EGFR,进而通过其下游Akt/ERK信号通路抑制结直肠癌细胞侵袭、迁移并诱导线粒体途径的细胞凋亡,有望成为靶向EGFR治疗结直肠癌的新型靶向药物。

次大风子素通过CNOT4介导的YAP泛素化降解抑制三阴性乳腺癌恶性进展的作用研究

该文旨在探讨次大风子素(hydnocarpin,HC)对三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的抑制作用及分子机制。采用CCK-8、实时无标记细胞分析技术(RTCA)、克隆形成实验检测HC处理后MDA-MB-231、MDA-MB-4362种TNBC细胞系增殖能力的变化;通过高内涵成像分析技术、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测HC对TNBC细胞迁移侵袭能力的影响;Western blot检测HC处理后上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及侵袭迁移相关蛋白E-cadhe-rin、vimentin、Snail、MMP-2、MMP-9的表达变化;Western blot、RT-qPCR检测Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)的表达及下游靶基因CTGF、Cyr61 mRNA及蛋白水平的表达变化;TNBC细胞瞬时转染Flag-YAP,过表达YAP,通过CCK-8实验、Transwell侵袭实验及划痕愈合实验检测YAP作为HC抑制TNBC恶性进展关键靶分子的作用;蛋白酶体抑制剂与HC共处理、泛素化免疫共沉淀实验检测HC诱导YAP降解的途径;基于靶点稳定性的药物亲和反应实验和微量热泳动技术检测HC与YAP及E3泛素连接酶Ccr4-not transcription complex subunit 4(CNOT4)之间的结合作用。结果表明HC显著抑制TNBC细胞增殖、克隆形成、侵袭及EMT;HC下调CTGF、Cyr61的mRNA及蛋白表达;HC下调YAP总蛋白水平,但对其基因水平无影响;过表达YAP能够拮抗HC对TNBC细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用;HC促进YAP通过蛋白酶体途径降解并上调YAP的泛素化水平;微量热泳动技术、基于靶点稳定性的药物亲和反应实验结果显示,HC、YAP、CNOT4分子之间存在直接结合作用。以上结果说明HC通过CNOT4介导的YAP泛素化及蛋白酶体降解抑制三阴性乳腺癌的恶性进展。