半胱氨酸、蛋氨酸对体外培养绒山羊次级毛囊生长及毛乳头细胞增殖的影响

旨在探讨半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)对体外培养燕山绒山羊次级毛囊(SF)生长及毛乳头细胞(DPCs)增殖凋亡的影响。本研究选取1只1周岁左右健康雄性燕山绒山羊皮肤若干,完整分离的次级毛囊随机分成Cys试验组和Met试验组,每组各浓度3个重复,每个重复8根毛囊,Cys试验组添加浓度分别为0、40、80、120、160和200μg·mL^(-1);Met试验组添加浓度分别为0、10、15、20、25和30μg·mL^(-1)。毛囊培养7 d,每隔24 h观察毛囊生长形态并测量毛囊生长长度。从燕山绒山羊次级毛囊中提取、纯化DPCs,细胞计数并绘制DPCs生长曲线,将DPCs随机分为Cys试验组和Met试验组,每组各浓度6个重复,Cys试验组添加浓度分别为0、20、40、60、80、100μg·mL^(-1);Met试验组添加浓度分别为0、2、4、6、8、10μg·mL^(-1)。培养2 h后用CCK-8试剂盒进行细胞增殖活力测定,确定燕山绒山羊DPCs中Cys和Met的最适培养浓度,利用qRT-PCR技术检测不同浓度Cys和Met的DPCs增殖相关基因(PCNA、CCND1、CDC42、CDK 4)、凋亡相关基因(P21、P53、Bax、Caspase-3、Bcl-2)、皮肤细胞分化相关基因(IVL)及角蛋白相关基因(K10、K 14)mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,添加80和120μg·mL^(-1) Cys与10、15、20和25μg·mL^(-1) Met均可显著影响次级毛囊生长速率和累计生长长度(P<0.01),且120μg·mL^(-1) Cys和20μg·mL^(-1) Met促生长效果最好;添加20、40和60μg·mL^(-1) Cys可以显著影响DPCs增殖(P<0.05),添加40μg·mL^(-1) Cys显著上调PCNA、CCND1、CDK4、Bcl-2、K10、K 14和IVL基因mRNA表达量(P<0.05);添加6μg·mL^(-1) Met可以显著影响DPCs增殖(P<0.05),并显著上调PCNA、CCND1、CDK4、P21、Bcl-2、K 10和K 14基因mRNA表达量(P<0.05)。综上,添加Cys和Met可以显著促进长绒期燕山绒山羊次级毛囊生长,最适添加量分别为120μg·mL^(-1)和20μg·mL^(-1);添加Cys和Met可通过上调细胞增殖、分化、角蛋白等基因mRNA、下调细胞凋亡基因mRNA表达,促进乳头细胞增殖、抑制细胞凋亡进而促进燕山绒山羊次级毛囊生长。

L-半胱氨酸对绵羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的影响

旨在探讨L-半胱氨酸(L-Cys)对体外培养绵羊卵巢颗粒细胞(GCs)增殖、凋亡和类固醇分泌的影响。本研究采集1~1.5岁龄体重相近饲养条件相同的30只健康性成熟小尾寒羊母羊新鲜卵巢,从优势卵泡(2~8 mm)中收集GCs,随机分为5组,每组6个重复,各组添加L-Cys浓度分别为0、100、300、500和700μmol·L^(-1),培养48 h后用CCK-8试剂盒进行细胞增殖活力测定,Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测GCs的凋亡情况,采用ELISA检测GCs培养液上清中孕酮和雌二醇的分泌水平并采用实时荧光定量PCR和Western blot分析L-Cys对绵羊颗粒细胞增殖相关基因(PCNA、CCND2、CCNB 1)、凋亡相关基因(BAX、Caspase-3、Bcl-2)和类固醇分泌相关基因的(STAR、3β-HSD、CYP 11A1、CYP 19A1)mRNA和蛋白表达的影响。结果显示,100、300和500μmol·L^(-1)组的L-Cys均可显著促进绵羊GCs的增殖活力(P<0.05),并显著抑制其凋亡率(P<0.05)。添加300μmol·L^(-1)的L-Cys显著抑制了孕酮(P 4,P<0.05)的分泌。进一步研究发现,300μmol·L^(-1)和500μmol·L^(-1)组的L-Cys可以上调增殖相关基因(PCNA、CCND2、CCNB 1)mRNA表达水平,其中300μmol·L^(-1)组的增殖蛋白(PCNA、CCND2、CCNB1)表达量显著上升(P<0.05);100μmol·L^(-1)和300μmol·L^(-1)组显著下调凋亡相关基因(BAX、Caspase-3)mRNA(P<0.05)及其蛋白表达水平(P<0.05)。添加300μmol·L^(-1)L-Cys显著降低了类固醇相关基因(STAR、3β-HSD)mRNA及蛋白表达水平(P<0.05),添加100μmol·L^(-1)和300μmol·L^(-1)L-Cys显著升高了类固醇相关基因(CYP 11A1、CYP 19A1)mRNA(P<0.05)及其蛋白表达水平(P<0.05)。综上,L-Cys通过上调基因PCNA、CCNB1、CCND2、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达、下调基因BAX、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达,促进绵羊GCs增殖,抑制其凋亡;L-Cys通过下调基因STAR、3β-HSD mRNA及其蛋白表达以及上调基因CYP 11A1 mRNA及其蛋白表达抑制P 4的分泌。

γ-氨基丁酸对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇激素分泌的影响

【目的】该文章旨在探究γ-氨基丁酸(GABA)对绵羊卵巢颗粒细胞(GCs)凋亡及类固醇激素分泌的影响。【方法】卵巢GCs培养液中分别添加0、10^(-8)、10^(-7)、10^(-6)和10^(-5)mol/L的GABA处理24 h后,采用CCK-8法和流式细胞术分别检测GCs增殖及凋亡情况,筛选出GABA适宜培养浓度用于后续试验,采用ELISA检测GABA对GCs雌激素(E_(2))及孕酮(P_(4))分泌的影响,RT-q PCR及Western blot技术检测促GCs增殖(PCNA、CCNB1、CCND1)、促凋亡(Caspase-3、Bax)、抗凋亡(Bcl-2)和类固醇激素合成相关基因(CYP11A1、St AR、3β-HSD、CYP19A1)m RNA及蛋白的表达。【结果】添加GABA处理绵羊卵巢GCs 24 h,各组均可显著促进GCs增殖(P<0.05),抑制其凋亡(P<0.05)。GABA可显著上调PCNA、CCNB1、CCND1、Bcl-2 m RNA及蛋白表达量(P<0.05),显著下调Bax、Caspase-3 m RNA及蛋白表达量(P<0.05)和Bax/Bcl-2比值(P<0.05)。GABA可显著促进P_(4)的分泌(P<0.05),显著抑制E_(2)的分泌(P<0.05)。显著上调St AR、3β-HSD、CYP11A1的m RNA及蛋白表达水平(P<0.05),显著下调CYP19A1的m RNA及蛋白水平(P<0.05)。【结论】GABA通过调节CCNB1、CCND1、PCNA、Caspase-3、Bcl-2、Bax基因表达促进GCs的增殖,抑制其凋亡;通过调节St AR、3β-HSD、CYP11A1、CYP19A1基因表达促进GCs的P_(4)分泌,抑制E_(2)生成。