安徽部分地区鸡场鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体感染与垂直传播调查

为了解安徽部分地区规模鸡场鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)流行感染情况,试验采集21家鸡场鸡血液样品进行血清学调查,并对3家种鸡场的种鸡群及其后代雏鸡进行MG和MS的病原检测,分析种鸡及其后代雏鸡的感染情况。结果显示,MG和MS的鸡场血清阳性率分别为95.24%和90.48%,鸡群平均血清阳性率分别为75.08%和77.01%;商品蛋鸡和种鸡的MG和MS血清阳性率高于育雏育成鸡;鸡群日龄越大,MG和MS的血清阳性率越高,其中300日龄以上鸡群的血清阳性率均为100%。病原检测发现,种鸡场存在不同程度的MG和MS感染,其中MS感染率高于MG;种鸡感染率与其后代雏鸡的垂直感染存在显著正相关,并且在垂直感染的雏鸡关节组织检测出MS病原。结果表明,MG和MS在安徽鸡场中的感染较为严重,垂直传播是雏鸡早期感染的重要途径,并且MS在雏鸡垂直感染的早期即可侵入关节组织。

迷宫型过孔密封圈在回中作动器中的研究及应用

回中作动器在活塞运动时,活塞头上的密封圈需反复通过筒体上的回中小孔,采用传统的橡胶O形密封圈或聚四氟乙烯组合密封圈无法满足活塞组件往复运动过程中对密封件的磨损,会出现密封损伤、内漏量偏大的情况。采用聚醚醚酮材料加工过孔(回中)密封圈,由于聚醚醚酮材料拥有优良的物理机械性能、兼具韧性和刚性,耐疲劳性、自润滑性优良,适用于耐磨耗的场合;同时,密封圈结构采用迷宫型切口,可有效防止油液泄漏。研究结果表明:新型迷宫型过孔密封圈经产品密封性能验证及工程化应用,密封效果良好,内漏量小,满足产品使用需求。

新型鸭源细小病毒安徽株AH-D15株的分离鉴定

为确定安徽省某鸭场发生的以雏鸭发育迟缓、鸭喙萎缩、舌头外伸下弯为特征的疾病病因,本研究利用PCR对病鸭样品进行检测,结果扩增出鹅细小病毒(GPV)特异性目的片段。将PCR阳性病料组织样品接种11日龄樱桃谷鸭胚,盲传3代后,可致鸭胚胚体出血严重,并且鸭喙畸形,证实分离到一株鸭源细小病毒(命名为AH-D15株)。利用第3代尿囊液感染2日龄健康樱桃谷肉鸭,2周后感染鸭出现短喙症状,并从鸭脑、肾、脾、胰腺和肝脏组织内检测到病毒。将分离病毒株的VP3核苷酸序列与Gen Bank中登录的GPV和番鸭细小病毒进行比对,结果表明AH-D15株与德国的VG32/1株和匈牙利的virulent B株亲缘关系最近,同源性分别为96.3%和96.5%。上述结果表明从病鸭体内分离到的鸭细小病毒可能来源于GPV,因此为该病的防控提供实验依据。

猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明,该方法最低可检测至101 copies·μL^(-1),且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13a方法灵敏度高、特异性强,为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段。

猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)和4型(PCV4)的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,根据Gen Bank已登录的PCV3和PCV4基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,经优化各反应条件,构建标准曲线,分析其敏感性、特异性和重复性,并利用建立的荧光定量PCR方法对采自安徽省的临床样品进行检测,与普通PCR方法进行一致性评价。结果显示,PCV3的标准曲线为Y=–3.534 6 logX+41.11(R^(2)=1.00),PCV4的标准曲线为Y=–3.382 5 logX+40.67(R^(2)=1.00)。PCV3和PCV4的检测限分别为49.5和27.1 copies·μL^(-1)。对猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无特异性扩增,组内和组间变异系数均<1%。临床样品检测结果显示,PCV3阳性检出率为40.8%,PCV4阳性检出率为20.4%,混合感染率为19.0%。建立了灵敏、特异,可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。

安徽六安地区1例鹅圆环病毒病PCR诊断与分析

[目的]对安徽六安某朗德鹅场送检的疑似圆环病毒病的病料进行鉴定。[方法]采集病例中鹅的肝脏,提取病毒DNA,根据Genbank已登录GoCV基因序列设计引物,通过PCR检测病料中GoCV,对扩增到的序列进行测序,最后将获得的序列构建进化树进行遗传进化分析。[结果]检测到大小为580 bp的目的条带,序列比对结果发现,鉴定株与山东分离株KT387277.1的遗传距离最近。[结论]该研究结果为了解该地区GoCV的流行情况提供了参考。

重组酶辅助扩增结合CRISPR/Cas13a检测禽腺病毒4型方法的建立

【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a)技术相结合,针对FAdV-4 Hexon基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以qPCR为对照方法,评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。【结果】本研究所建立的方法反应过程均在37℃恒温条件下完成,反应体系可检测的最低扩增拷贝数为101 copies/μL,灵敏度高,且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与qPCR检测的阳性检出率一致。【结论】建立的RAA-Cas13a方法检测FAdV-4具有简便、灵敏、特异等特点,可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。

MIL-101(Cr)-NH_2负载Pd低温催化糠醛高选择性加氢生成四氢糠醇（英文）

随着资源枯竭和环境污染严重问题的凸显,生物质转化的研究越来越多,特别是生物质催化裂解制备生物燃料及高附加值的化学品.糠醛是一种半纤维素酸解的产物,也是生产糠醇、四氢糠醇、2-甲基呋喃、环戊酮等的重要原料.其中四氢糠醇既可以用于生产其他高附加值化学品,也可以用作生物燃料或者燃料添加剂.虽然Pd/MFI,Ni/SiO_2,Pd-Ir/SiO_2等催化剂均可用于糠醛选择加氢制备四氢糠醇,但是反应通常在高温高压条件下进行.为此我们希望找到一种在温和条件下使用的高效催化剂.MOF多孔材料具有丰富的孔道结构、极高的比表面积、表面可修饰的特点,还可与其他客体发生相互作用,进而影响催化性能.因此本课题组合成了一种含有氨基的MOF材料MIL-101(Cr)-NH_2,进一步利用表面氨基吸附Pd的氯酸盐前体,经还原直接制得负载型催化剂Pd@MIL-101(Cr)-NH_2,并用于糠醛选择加氢反应.本文采用X射线粉末衍射(PXRD)、热重分析(TG)、N2物理吸附-脱附、透射电镜(TEM)等手段表征了所制的MOFs和催化剂.通过将MIL-101(Cr)-NH_2和不同Pd@MIL-101(Cr)-NH_2的XRD谱与标准谱图对比,发现MIL-101(Cr)-NH_2已成功合成,并在催化剂制备过程中和反应之后仍然保持稳定.TG结果表明,所制备MIL-101(Cr)-NH_2在低于350°C时结构不会被破环.MIL-101(Cr)-NH_2的比表面积可达到1669 m^2 g^(-1),孔容达1.35 cm^3 g^(-1),从而为Pd纳米粒子均匀分散在载体上提供了可能性.各Pd@MIL-101(Cr)-NH_2样品的TEM照片我们看出,Pd纳米粒子可均匀分散在MIL-101(Cr)-NH_2上,粒径为3-4 nm.对比实验表明,氨基与金属的相互作用有利于Pd纳米粒子分散均匀.将Pd@MIL-101(Cr)-NH_2用于糠醛选择加氢反应时,在40℃,2 MPaH_2的温和条件下,反应6 h后糠醛完全转化为四氢糠醇其选择性接近100%.表现出比文献报导的更加优异的催化性能.这得益于高度均匀分散的Pd纳米粒子,以及催化剂载体与Pd纳米粒子的配位作用和π-π相互作用.结果还表明当高于80℃反应时,即有副产物生成,进一步提高反应温度会促进环戊酮的生成.可见,Pd@MIL-101(Cr)-NH_2所表现的低温高加氢活性对提高四氢糠醇选择性至关重要.

口疮病毒020基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。

应用发酵牛粪垫料提高奶牛生产性能的研究

[目的]评估发酵牛粪对奶牛的安全性,并检验其在生产中的应用效果。[方法]比较发酵前后牛粪水分的变化,检测其细菌种类和数量,评价发酵牛粪的安全性。[结果]发酵牛粪没有能诱使奶牛发病的致病菌。临床应用时,试验组牛舍NH3含量稍高于对照组;试验组乳房炎和肢蹄病的发病率均低于对照组。2组隐性乳房炎增幅近似;试验组牛体清洁度评分优于对照组;试验组躺卧率高于对照组;发酵牛粪对奶牛的奶产量基本没有影响。[结论]发酵牛粪作为牛床垫料是可行且安全的。

抗羊口疮病毒囊膜蛋白B2L小鼠多克隆抗体的制备和应用

目的获取羊口疮病毒(ORFV)囊膜蛋白B2L并制备鼠抗B2L蛋白多克隆抗体。方法采用PCR扩增获得B2L基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a和真核表达载体p3×FLAG-CMV-14。两个重组表达载体均经过鉴定,重组原核表达载体使用BL21大肠杆菌表达,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。通过Tris-尿素溶液洗去非目的蛋白,Western blot法鉴定。将定量的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗ORFV B2L多克隆抗体。将真核表达重组质粒p3×FLAG-B2L转染Vero细胞、BHK-21细胞,使用间接免疫荧光法(IFA)对抗B2L蛋白的多克隆抗体鉴定,并应用于免疫组织化学染色检测患病羊唇部组织ORFV的表达。结果 Western blot法确定了制备的B2L蛋白的特异性; IFA结果表明制备的小鼠抗B2L多克隆抗体有特异性和反应原性,免疫组织化学染色法结果表明该抗体可以检测出患病羊唇部组织的ORFV。结论成功制备了特异性的小鼠抗B2L多克隆抗体。

猪伪狂犬病毒安徽株gE基因的克隆和序列分析

参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对猪伪狂犬病病毒安徽分离株的gE基因进行PCR扩增和序列分析,扩增的目的片段大小为632 bp。应用DNAStar软件对gE基因序列核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分析并绘制遗传进化树。结果表明,猪伪狂犬病病毒安徽分离株之间的核苷酸同源性分别为96.8%～99.7%,氨基酸序列同源性为97.9%～100.0%,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株的核苷酸同源性为97.0%～99.7%,氨基酸序列同源性为97.4%～100.0%。进化树分析表明,安徽分离株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。

鸭抗病毒蛋白(viperin)在转染的BHK-21细胞表达并抑制鸭坦布苏病毒出芽

目的探索鸭抗病毒白(viperin)对鸭坦布苏病毒(DTMUV)增殖的影响。方法使用生物学信息学方法分析鸭viperin基因,构建系统发育树。构建原核表达质粒pGEX-6P-viperin和真核表达质粒pEGFP-N1-viperin,分别转化Rosseta感受态细胞和转染BHK-21细胞。用DTMUV分别感染真核表达质粒和空载体质粒的BHK-21细胞,利用实时荧光定量PCR检测细胞沉淀和上清中DTMUV的含量,利用质谱的方法鉴定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)单克隆抗体捕获的结合蛋白。结果鸭viperin基因与其他种属viperin基因有显著差异。鸭viperin蛋白能成功在BHK-21细胞表达,鸭viperin抑制DTMUV在BHK-21细胞中的出芽。质谱分析结果显示转染真核表达质粒的细胞中可能存在6种影响抑制DTMUV增殖、出芽的蛋白。结论鸭viperin蛋白可在BHK-21细胞表达,且能抑制鸭坦布苏病毒出芽。

智能测控系统USB接口功能的设计与实现

以静电探针测量系统为应用背景,提出并实现了主从设备之间的USB通信。在简要介绍系统结构和硬件设计的基础上,详细地阐述了一种通用的基于ARM微处理器的USB固件程序和Windows下USB驱动程序设计方法,并设计了一套主从设备通信交互协议。该设计已在静电探针测量系统中得到应用,对USB技术在智能设备中的应用具有很好的现实意义。

安徽省5株新型鹅星状病毒的分离鉴定与遗传进化分析

为研究近年来引起雏鹅痛风病的新型鹅星状病毒流行毒株的病原学和遗传学特征,于2018—2021年从安徽省疑似感染新型鹅星状病毒的雏鹅中采集病料,使用健康鹅胚进行病毒分离,并对分离到的毒株进行全基因组测序和序列分析。结果表明,共分离鉴定到5例新型鹅星状病毒感染样品,利用鹅胚盲传3代成功分离到5株新型鹅星状病毒,均可在鹅胚上稳定传代,分别将其命名为AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2和HR2110/1株。全基因组测序结果表明,5株分离毒株的基因组全长均为7175 nt。系统进化树分析结果表明,5株分离毒株均属于致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒,但2019年前的毒株与2019年后的毒株处于不同的进化亚分支上。新型鹅星状病毒在我国已发生变异,出现了新的进化亚分支,但优势基因型是否发生变化还有待进一步研究。

六安地区猪细小病毒流行病学调查

为了解六安地区猪细小病毒(PPV)感染和毒株变异情况,采用荧光PCR对2022年3~4月采集自六安地区11家规模猪场185份血清样本进行检测,并对阳性样本进行PPV VP2基因的扩增和分析。结果显示,当前六安地区猪群中PPV感染较为普遍,总体样本阳性率为23.2%(43/185),猪场感染率为45.45%(5/11),感染猪场的样品阳性率为10%~100%;自5家阳性猪场扩增的PPV VP2基因序列完全相同,与参考毒株均具有较高的序列同源性(94.8%~98.8%)和较近亲缘关系。本研究为六安地区猪细小病毒病防控提供了参考和依据。

抗鸭坦布苏病毒病卵黄抗体的制备及应用试验

为探索高免卵黄抗体对鸭坦布苏病毒病的防治效果,本研究以鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)AH-F10株制备的灭活免疫制剂免疫健康高产蛋鸡,应用琼扩方法检测卵黄抗体效价,收集高效价卵黄,采用氯仿抽提和硫酸铵盐析法纯化卵黄抗体,测得抗坦布苏病毒卵黄抗体琼扩效价达1∶32以上,动物试验结果表明其对鸭坦布苏病毒病有明显的防治效果。

Cu/MgO催化剂的MOCVD法制备及其γ-戊内酯加氢制1,4-戊二醇性能（英文）

以Cu(acac)2为金属有机铜前体,层状MgO为载体,采用金属有机化学气相沉积方法(MOCVD)制备了Cu/MgO催化剂,并通过X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、场发射扫描电镜(FE-SEM)、透射电子显微镜(TEM)和N_2物理吸附等方法对Cu/MgO催化剂结构进行表征。结果表明,有机铜前体沉积在了MgO上,并且在沉积后,载体MgO的晶体结构仍然保留完整。利用生物质平台分子γ-戊内酯加氢反应来评价Cu/MgO催化剂的催化性能。研究表明,在473 K和10 MPa反应条件下,18%Cu/MgO催化剂表现出优异的催化活性(90.5%)和1,4-戊二醇选择性(94.4%),且催化剂循环三次,催化活性没有显著降低。

鸭坦布苏病毒囊膜糖蛋白结构域3(ED3)单克隆抗体的制备及其中和活性分析

目的以纯化的重组鸭坦布苏病毒(DTMUV)囊膜糖蛋白结构域3(ED3)蛋白作为免疫原,制备ED3蛋白的单克隆抗体并研究其中和活性。方法利用反转录PCR扩增DTMUV AH-F10株ED3基因,构建重组表达载体pET32a-ED3并转化至表达菌株Rosetta,诱导表达后利用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与Sp2/0细胞进行细胞融合,采取有限稀释法筛选杂交瘤细胞并大量制备单克隆抗体。利用Western blot法、间接免疫荧光法、ELISA及分型试剂盒对单克隆抗体进行鉴定并通过病毒中和试验检测抗体中和效价。结果成功表达DTMUV ED3蛋白,并制备3株ED3蛋白的鼠源单克隆抗体B9D10C7、B9D7B8G10、B9D7B8F11,其亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG2b,腹水间接ELISA检测抗体效价均达到1∶51200,且能够识别DTMUV的E蛋白,具有一定的中和活性。结论获得3株特异性强、敏感性高的DTMUV ED3的单克隆抗体。

稳定表达禽β防御素2的DF-1细胞系的建立及其抗大肠杆菌活性

旨在建立一株稳定表达禽β防御素2(AvBD2)的细胞系,并检测细胞系分泌产物对耐药菌株的抑制效果。首先,根据同源重组设计方法设计一组含有同源臂的AvBD2基因扩增引物及载体反向扩增引物,将片段连接至pLOV-eGFP真核表达载体,构建真核重组质粒pLOV-eGFP-AvBD2,利用三质粒表达系统将重组质粒与慢病毒包装质粒pSPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集细胞分泌上清液感染DF-1细胞,嘌呤霉素最适浓度筛选获得阳性克隆细胞系,通过RT-PCR技术和Western Blot方法对该细胞系构建结果加以验证;将细胞系分泌产物与耐药大肠杆菌菌株混合培养后,检测该蛋白抗菌效果,并通过扫描电镜观察菌体的损伤现象。结果表明,已成功构建一种稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,其最适筛选浓度为含有1μg/mL的嘌呤霉素的细胞培养液。该细胞系传递20代后,在mRNA转录水平及蛋白表达水平均验证正确,将细胞系的分泌产物培养耐药大肠杆菌,细菌存活率曲线显示随着培养时间的增加,细胞系上清可明显抑制耐药菌株的增殖,在培养第5小时使供试菌的存活率低于50%。扫描电镜显示供试菌体表面皱缩,存在明显损伤,而对照组菌体光滑饱满。建立了稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供探索方向,同时也为后续评价和研究AvBD2的抗菌作用奠定基础。