乙型脑炎病毒部分NS1基因假病毒的构建

目的构建耐核酸酶的含乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)部分非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)基因的假病毒,为JEV的实验室核酸检测提供质控品,提高检测质量。方法将JEV部分NS1基因、蚊18S RNA基因和人GAPDH基因片段次序连接克隆到该质粒上,构建重组载体pET-MS2-JEV;转化大肠杆菌后表达纯化假病毒,并对其进行耐受性和稳定性评估。结果构建了重组载体pET-MS2-JEV,表达获得的假病毒具有耐核酸酶、耐物理化学因子的特性,可在4℃和-20℃条件下稳定保存。结论本研究获得了稳定性好的含JEV部分NS1基因的假病毒,可作为JEV实验室核酸检测的质控品。

马达里亚加病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

目的建立马达里亚加病毒(Madariaga virus,MADV)早期且快速的TaqMan反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法。方法从GenBank中下载MADV基因序列,根据多序列比对结果选择MADV的NSP1基因中的高保守序列片段设计引物与探针,利用体外转录的RNA标准品建立了MADV的绝对定量分析模型,并进行灵敏度和特异性评价以及重复性验证。结果该检测方法的灵敏度为1.0×10^(2)拷贝/反应,与其它虫媒病毒无交叉反应,重复性检测变异系数均小于1.5%。通过本研究建立的快速检测方法对源自宁夏回族自治区、浙江省和云南省的共计81份不明原因脑炎病例血清标本及161批库蚊标本进行了测定,检测结果均为阴性。结论成功建立了MADV TaqMan RT-PCR的快速检测方法,可应用于实验室的早期检测。

生态文明视域下美丽陕西建设水平时空测度

为测度美丽陕西建设水平,以生态文明视域,从生态-经济-社会复合系统切入,构建美丽陕西综合评价指标体系及三维垂直评价模型,研究结果表明:美丽陕西建设水平在时序上整体呈波动式上升趋势;空间格局水平由高到低排序为关中(西安市)>陕南(汉中市)>陕北(榆林市),形成关中(西安市)领跑式、陕南(汉中市)突破式和陕北(榆林市)跨越式,以关中为同心圆向南北辐射式环向发展格局,依据评价结果,提出美丽陕西均衡绿色环保生态可持续发展路径。

重庆市库蚊标本中宜昌病毒的分离鉴定

目的对2017年采集自重庆地区蚊虫标本携带的病毒进行分离鉴定。方法采用组织细胞培养法进行病毒分离,应用高通量测序技术获得病毒分离物的全基因组序列,采用系统发育法进行种类及分子特征分析。结果库蚊标本来源的病毒阳性分离物CQFD2017能引起白纹伊蚊细胞C6/36病变,但不能引起金黄地鼠肾细胞BHK-21、非洲绿猴肾细胞Vero病变。CQFD2017全基因组序列长度为20893 bp,包含6个开放阅读框。系统进化分析发现,该毒株位于Nidovirales病毒目Mesoniviridae病毒科的Yichang病毒所在的进化分支,与Yichang病毒(NC_040534)的核苷酸一致性为98.6%,ORF1a和ORF1b区氨基酸一致性分别为99.06%和99.15%,因此将该毒株命名为Yichang病毒CQFD2017株。结论2017年重庆市库蚊标本分离的CQFD2017株为Yichang病毒。

我国蚊传虫媒病毒及蚊传虫媒病毒病现状及展望

全世界已经发现300余种蚊传虫媒病毒,其中登革病毒、基孔肯雅病毒、乙脑病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒等在世界各地流行造成巨大公共卫生负担,引起全社会广泛关注。我国地域广阔、地理景观复杂,适宜多种蚊传虫媒病毒的繁殖,因此我国蚊传虫媒病毒的种类及其地域分布等备受关注。我国自20世纪80年代起对各地采集的100余万只蚊虫和人畜动物(份)标本,利用组织细胞培养法和动物接种等方法分离鉴定出隶属于黄病毒科、布尼亚病毒科、披膜病毒科和呼肠孤病毒科等9科38种蚊传虫媒病毒。现场和实验室检测结果提示我国存在多种蚊传虫媒病毒病,包括流行性乙型脑炎、登革热、西尼罗脑炎和Tahyna病毒感染引起的发热性疾病等。本文对中国蚊传虫媒病毒、蚊传虫媒病毒与传播媒介以及蚊传虫媒病毒性传染病的种类和地域分布等进行总结,为我国蚊传虫媒病毒及其相应疾病的预防控制、疫情处理、疾病预警预测等提供了技术支撑,对亚洲乃至国际虫媒病毒病的联防联控等也具有长远和现实意义。

中国乙脑病毒研究进展

20世纪40年代,中国科学家从病毒性脑炎患者标本首次分离到乙脑病毒,此后陆续从乙脑患者标本、多种蚊虫媒介标本和动物标本分离到大量乙脑病毒。本文系统介绍中国在乙脑病毒的地域分布、蚊虫传播媒介以及乙脑病毒分子遗传进化等方面的研究现状,以推动相关研究。

我国西尼罗病毒及人畜动物感染:现场调查与实验室检测

西尼罗病毒为蚊虫传播的虫媒病毒,同时也是人畜共患病病原体,1937年首次在非洲分离到,此后发现西尼罗病毒感染而引起的发热性疾病的流行。1999年西尼罗病毒首次传入美国纽约地区引起成人病毒性脑炎的流行,这也是首次报道西尼罗病毒感染引起群体性成人病毒性脑炎的流行。此后西尼罗病毒及其人畜动物感染迅速扩散至美国全境,在全世界引起轰动。目前认为西尼罗病毒是在世界范围分布最广的新发蚊传虫媒病毒,人类或者动物通过蚊虫叮咬感染西尼罗病毒后可出现发热、脑炎(脑膜炎)等病症,极少数病例还可表现为严重胰腺炎、肝炎、心肌炎、流产甚至死亡,引起世界性的巨大公共卫生负担。本文介绍我国在西尼罗病毒分离鉴定,及其成人病毒性脑炎的流行以及西尼罗病毒与伤寒菌合并感染等的现场调查和实验室检测的研究进展,以期推动我国在西尼罗病毒及其感染方面的防控及研究工作。

阿龙山病毒及松岭病毒多重实时荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种多重实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(多重实时qRT-PCR)法,用于阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)及松岭病毒(Songling virus,SGLV)核酸的快速检测。方法 针对ALSV NS 3基因和SGLV S基因保守区设计特异性引物及TaqMan探针,建立针对2种病毒的多重实时qRT-PCR检测方法,评价方法的特异性、灵敏度和重复性,并应用蜱标本对该方法进行应用评价。结果 该检测方法与森林脑炎病毒等其他6种虫媒病毒无交叉反应,灵敏度达1×101拷贝/μl,重复性检测的循环阈值(Ct)变异系数均<2.00%;运用该方法,从2019年黑龙江省采集的30组蜱标本中检出2组ALSV阳性,1组SGLV阳性。经验证,该方法与普通PCR方法检测结果的一致性为100%。结论 建立了敏感性高、特异性好的ALSV和SGLV多重实时qRT-PCR快速检测方法。

不同基因型别乙型脑炎病毒在不同细胞系上的生长特点比较

目的研究不同基因型别乙型脑炎病毒在不同细胞系上的生长特点, 为乙脑病毒的研究中细胞系的选择提供科学依据。方法选择BHK-21、Vero、C6/36、PK-15、DF-1、N2a、SH-sy5y和MDCK细胞系, 通过空斑测定法和RT-qPCR法评价基因1型(G1, NX1889株)、基因3型(G3, P3株)和基因5型(G5, XZ0934株)乙脑病毒在上述细胞系中的增殖能力。结果 3种基因型别乙脑病毒在BHK-21、Vero、C6/36、DF-1、N2a和PK-15细胞系中存在明显的细胞病变效应(CPE), 在同一种细胞系中引起CPE的特点并未观察到明显不同。病毒感染SH-sy5y和MDCK细胞系后没有明显的CPE出现, 但是在SH-sy5y细胞系中存在病毒的增殖, 而MDCK细胞系为非敏感细胞系。G1、G3和G5型乙脑病毒在BHK-21、Vero和SH-sy5y细胞系中的增殖曲线没有明显差异;在C6/36和PK-15细胞系中, G1型乙脑病毒的滴度高于其他两型乙脑病毒;在DF-1细胞系中, G5型高于其他两者, 在N2a细胞系中, G5型低于其他两者。结论 3种不同基因型别的乙脑病毒在不同细胞系中的增殖存在差异, 可为针对乙脑病毒不同方向的研究提供选择参考。

单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测方法的建立

目的建立单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的双重微滴式数字PCR检测方法。方法基于单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的保守区域,设计特异性引物探针,通过筛选引物探针组合,优化双重微滴式数字PCR反应退火温度及引物探针浓度比,建立双重单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测反应体系,对其他病毒进行检测,对临床样本进行验证,对建立的双重微滴式数字PCR方法的灵敏性、特异性及重复性进行分析。结果单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测方法最佳引物和探针浓度分别为800 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度是56℃;双重微滴式数字PCR检测方法的标准曲线相关系数(R2)为0.99,呈现良好的线性关系;灵敏度高,单纯疱疹病毒Ⅰ型最低检测下限为2.97拷贝/µL,水痘-带状疱疹病毒最低检测下限为2.73拷贝/µL;重复性好,变异系数小,检测结果稳定;特异性强,未发现与单纯疱疹病毒Ⅱ型、EB病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、人巨细胞病毒、肠道病毒71型、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒以及人类核酸有交叉反应。结论本试验建立的单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR方法灵敏性强、特异性高、重复性好,可为不同场景下2种病毒的快速定量检测提供解决方案。

黑龙江省桦南县蜱中松岭病毒的检测

目的对2023年采集自黑龙江省佳木斯市桦南县的蜱标本进行松岭病毒筛查。方法采用形态学方法对蜱标本进行分类鉴定,反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)方法对采集的蜱标本进行松岭病毒(Songling virus,SGLV)筛查,并通过Sanger测序法获得阳性病毒基因序列信息。结果共采集421只蜱标本,包括森林革蜱184只(43.71%),全沟硬蜱115只(27.32%),日本血蜱32只(7.60%),嗜群血蜱43只(10.21%),长角血蜱7只(1.66%)及未鉴定若蜱40只(9.50%),其中1只雌性嗜群血蜱(编号:2023JMS365)经RT-qPCR检测为SGLV核酸阳性。系统进化分析显示,2023JMS365基因组L、M和S节段与SGLV参考株HLJ1202株的核苷酸一致性分别为96.78%、92.11%和97.59%,氨基酸一致性分别为99.22%、97.50%和93.28%。结论首次在黑龙江省佳木斯市桦南县的嗜群血蜱中检测到松岭病毒。

2018—2023年中国森林脑炎流行特征分析

目的分析2018—2023年中国森林脑炎的流行特征,揭示其发生规律,为制定森林脑炎的防控策略提供科学依据。方法利用中国疾病预防控制信息系统,收集2018—2023年间中国森林脑炎病例数据,采用描述性流行病学方法进行分析。结果2018—2023年,全国森林脑炎报告病例共656例,年平均发病率为0.008/10万,死亡2例,病死率为0.30%。报告病例主要集中在内蒙古自治区、黑龙江省和吉林省,占总报告病例的98.6%,该3省(地区)年平均发病率0.06/10万~0.21/10万,年平均实验室确诊率为53.35%,存在显著的地区间差异(P<0.05)。森林脑炎发病高峰在5-7月,其间报告病例数占总病例数的89.33%。发病人群主要为农民、家务及待业人员和工人,构成比分别为46.95%、27.13%、11.43%。全国报告病例主要集中于40~69岁年龄组,其中50~59岁年龄组占比最高,为37.65%,且男性发病多于女性。结论2018—2023年中国森林脑炎报告病例主要集中于内蒙古自治区东部、黑龙江省和吉林省,春夏季为发病高峰期,50~59岁年龄组、农民及家务待业人员是主要发病群体。

成人乙脑:乙脑预防控制的新挑战

我国于2008年将乙脑疫苗纳入15岁以下儿童计划免疫管理,之后我国儿童型乙脑发病人数大幅度降低。但是自2006年以来我国北方地区多次发生成人型乙脑的暴发流行,对当地形成巨大的公共卫生负担。此外,日本、韩国、马来西亚等国也出现大量成人型乙脑,成人型乙脑已成为国内外关注的公共卫生问题。本文介绍国内外成人型乙脑的流行现状,并对成人型乙脑预防控制的相关问题进行讨论。

埃博拉病毒病——病死率极高的人畜共患病

埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起人和灵长类动物的一种以发热和出血为主要临床特征的烈性传染病。本病于1976年首次发现于非洲的扎伊尔和苏丹地区,此后在非洲造成多次大规模流行,其中2014—2016年西非暴发的疫情是有史以来规模最大、最复杂的埃博拉疫情,导致的病例和死亡人数超过了历次疫情病例和死亡人数的总和,截至2022年共报告约3.5万例埃博拉病毒病病例,死亡约1.5万例。埃博拉病毒病在非洲大流行期间还外溢至美洲和欧洲等非洲大陆以外地区,成为世界关注的公共卫生问题。2022年在非洲乌干达和刚果共和国再次出现该病流行,引起了全世界的广泛关注。本文对埃博拉病毒病的历史、流行病学分布、病毒感染途径、患者临床症状、诊断、治疗以及预防与控制等方面进行系统总结,为国内相关工作者提供参考。

山西省武乡县1株白蛉携带病毒(SXWX1816-2)的分离与鉴定

目的调查山西省武乡县白蛉标本携带病毒的种类及其流行情况。方法2018年6月在山西省武乡县采集白蛉标本,使用实验室保存的金黄地鼠肾细胞(BHK-21细胞)和白纹伊蚊卵细胞(C6/36细胞)2种细胞系进行病毒分离,阳性分离物经病毒RNA提取、cDNA文库制备后,进行病毒基因扩增与核苷酸序列测定及系统进化分析。结果SXWX1816-2病毒分离株可引起哺乳动物细胞(BHK-21细胞)病变,但是对昆虫细胞(C6/36细胞)并不引起病变。病毒基因组核苷酸序列测定和分析结果显示该病毒M基因和S基因编码区核苷酸序列长度分别为4089和1611 nt;病毒M基因和S基因核苷酸/氨基酸序列同源性分析和分子遗传进化分析结果均表明SXWX1816-2分离株隶属于白纤病毒科白蛉病毒属,并与我国此前分离的武乡病毒(Wuxiang virus,WUXV)的同源性最高,病毒基因分子遗传进化关系最近。结论明确了我国白蛉分离病毒(SXWX1816-2)的分类地位,研究结果为我国吸血昆虫携带病毒,特别是白蛉携带和传播病毒的研究提供了重要的基础数据。

流行性乙型脑炎和西尼罗病毒双重微滴数字PCR检测方法的建立

目的建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)的双重微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法。方法基于已设计的JEV和WNV引物探针,建立JEV和WNV双重ddPCR检测反应体系,摸索检测的敏感性、特异性和可重复性,灵敏度与双重荧光定量PCR(qPCR)的每个反应管内荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数(Ct)值做对比。结果双重ddPCR检测反应体系对JEV和WNV的检测灵敏度均可达到102拷贝/µl,该方法的可重复性、特异性良好,未发现与登革病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、蜱传脑炎病毒以及人类基因组有交叉反应。结论建立的双重ddPCR方法能敏感、特异检测JEV和WNV,为不同场景下这2种病毒的检测提供了解决方案。

G1/G3/G5型乙型脑炎病毒国家标准株实验室鉴定与评价

目的确定G1、G3和G5三个基因型别的乙型脑炎病毒(乙脑病毒)国家标准株实验室鉴定评价指标,评价乙脑病毒国家标准株。方法依据病原微生物菌(毒)种国家标准株评价技术标准,基于乙脑病毒研究工作中的应用,以形态学特征、生物学特征、分子生物学特征等数据为基础,鉴定G1型(NX1889株)、G3型(P3株)和G5型(XZ0934株)三个基因型别乙脑病毒株的特征。结果乙脑病毒电镜下为球形颗粒,直径约为60 nm;感染BHK-21、Vero细胞后,细胞病变效应以细胞圆缩脱落为主,感染C6/36细胞后,表现为细胞融合和脱落;病毒滴度为10^(5)~10^(7)PFU/ml,噬斑大小存在型别差异;G1、G3和G5型乙脑病毒三周龄小鼠腹腔攻毒的半数致死量为50.51 PFU、6.98 PFU、8.13 PFU,五周龄小鼠颅内攻毒的半数致死量为3 PFU、0.3 PFU、1.35 PFU;G1、G3和G5型乙脑病毒基因组全长分别为:10967 bp、10976 bp和10983 bp。结论通过乙脑病毒电镜、细胞、动物和基因组等实验室指标的确定,鉴定与评价了三个基因型别乙脑病毒国家标准株,为其他病毒国家标准株的鉴定与评价提供了参考。

基于文献计量学的中国西尼罗病毒研究特征分析

为了解我国关于西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)文献的各项研究特征,本文应用文献计量学方法对1942-2021年中国知网(CNKI)和Web of Science(WOS)数据库收录的WNV文献进行分析。由于1999年美国出现WNV暴发流行,全球发文量显著增加,2006年达到峰值,将发文情况总体分为3个阶段:1999年之前对于WNV的关注度有限;1999-2006年,全球整体发文量大幅增加,国内文献数量随之增加,以综述和国外疫情介绍类为主;2006年后全球发文量在300篇/年左右,国内文献类型以实验研究类为主。当前研究热点主要集中在病原学机制研究、暴发疫情、监测与检测、传播媒介和传播模式等方面,而国内以检测方法的建立为主。国内WNV研究主要局限在数家国家级研究机构。鉴于中国已在局部地区发现WNV流行,在今后的研究工作中,亟需在开展WNV病原学、致病机制研究的基础上,建立全国监测体系、提高检测能力、扩大监测范围、增加检测内容,为WNV病防控策略的制定及潜在暴发流行的应对提供科学依据。

水痘带状疱疹病毒gE蛋白联合不同佐剂对小鼠免疫效果的比较

目的比较利用AS01和Al/CpG联合佐剂,水痘带状疱疹病毒糖蛋白E(Varicella Zoster virus glycoprotein E,VZV gE)在BALB/c小鼠体内的免疫效果。方法BALB/c小鼠分别于0和21天免疫,小鼠血清抗体检测采用酶联免疫吸附实验;用VZV检测小鼠血清中和抗体滴度;酶联免疫吸附斑点实验检测细胞免疫反应。结果经过2次肌肉注射免疫,实验组(Shingrix、gE+Al/CpG和gE+AS01)中小鼠均能产生高滴度的中和抗体,增加分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数量。gE+Al/CpG免疫组中小鼠产生的中和抗体滴度最高(1943),但是AS01佐剂组(Shingrix和gE+AS01)中小鼠产生的分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数量高于Al/CpG佐剂组(gE+Al/CpG)。相比于AS01佐剂,Al/CpG佐剂诱导小鼠产生了偏向Th2型的体液免疫应答。各实验组中小鼠CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例均没有统计学差异。结论Al/CpG佐剂联合gE蛋白诱导高滴度中和抗体,但是诱导产生的细胞免疫应答强度低于AS01佐剂组。

水痘-带状疱疹病毒RAA检测方法的建立及初步应用

目的建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)的重组酶等温扩增(recombinase-aid amplification,RAA)快速检测方法。方法通过全球共享数据库下载VZV全基因组序列进行比对分析,针对四个保守基因分别设计特异性引物与探针并筛选出最佳组合,通过引物与探针浓度梯度筛选出最佳反应体系,建立荧光型RAA检测方法。用VZV阳性质粒标准品与梯度稀释的临床样本评价方法的灵敏度,以最低检出极限浓度的阳性质粒标准品进行重复实验评价方法的重复性,以其他病毒核酸评价方法的特异性,同时用本方法和荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)对临床样本进行检测并对检测结果进行比较。结果本方法筛选出针对开放阅读框架(open reading frame,ORF)28基因的引物对F2/R2与探针P2为最佳组合;考虑到成本因素,最佳引物浓度为500 nmol/L,最佳探针浓度为280 nmol/L;最低检出极限为101拷贝/μL,最低可检测到Ct值为36.027的临床阳性样本;重复实验的检测结果一致;该方法与其他病毒核酸无交叉反应;临床阳性样本的检出率为93.33%,与qPCR检测结果几乎完全一致。结论本方法操作简便、灵敏度高、特异性强、对实验条件要求低、检测结果直观可视,在20 min内就能够检测出样本中的VZV核酸,是一种可以被临床检测考虑的VZV快速检测方法。