犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石皮下成骨的实验研究

目的:犬自体皮下非受力部位植入犬骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)复合珊瑚羟基磷灰石(corallinehydroxyapatite,CHA),观察成骨情况及其转归。方法:体外分离培养、成骨诱导、扩增犬BMSCs,并通过细胞化学、免疫细胞化学检测成骨表型。将第2代细胞接种于CHA上,形成细胞-材料复合物,植于9只犬右侧腹部皮下,并在对称部位植入CHA作为对照。术后4、12、26周取材,HE染色,观察新生组织结构;通过形态计量学分析,对成骨情况量化,并行t检验。结果:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶染色阳性,免疫细胞化学显示骨钙蛋白表达阳性。HE染色示植入4周后,无明显骨形成;12周后,实验组有较多新生骨小梁形成,苦味酸-硫堇和Masson染色示骨基质和胶原形成良好;26周后,实验组骨小梁量有减少趋势。图像分析显示,实验组12周成骨量最高,差异有统计学意义。结论:犬BMSCs诱导后具有成骨活性,复合CHA后,可促进形成组织工程化骨。在无应力刺激情况下,随时间延长,局部成骨活动减弱。

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性。方法收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kap low氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达。结果诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成。结论分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征。

差速粘附方法分选表皮干细胞及其评价

目的 评价细胞外基质差速粘附法在分选表皮干细胞中的作用。方法 人角质形成细胞接种在Ⅳ 型胶原涂被的培养皿上进行粘附试验。粘附细胞为实验组,未粘附细胞及未分选的细胞分别为对照组1和对照组2。三组细胞分别进行克隆形成率测定、细胞周期测定和细胞超微结构观察;应用免疫细胞化学、免疫荧光和流式细胞仪检测β1整合素、细胞角蛋白K19、外皮蛋白(Involucrin)等标记物的表达。结果 与对照组1相比,实验组细胞较小,细胞表面的微绒毛较长而密。实验组细胞克隆形成率明显高于对照组1(P<0.05)。β1整合素、K19、Involucrin在不同组别和不同代次的细胞间表达有显著差别。细胞周期分析显示,实验组细胞86.9％处于G0/G1,8.8％在S期。对照组1和对照组2的细胞处于G0/G1期分别为74％和79.5％,处于S期分别为19.2％和12.3％。结论 细胞外基质差速粘附法可用于分选表皮干细胞。但要达到较高纯度,还需辅以其它手段。

血管内皮细胞和平滑肌细胞-聚羟基乙酸复合物置入裸鼠皮下构建人工血管(英文)

背景:有实验表明聚羟基乙酸支架材料已成功在裸鼠及大型哺乳动物体内构建形成了组织工程化软骨、骨、肌腱等组织,将血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸能否在裸鼠皮下形成血管样结构?目的:采用新生婴儿脐静脉血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸形成的复合物移植于裸鼠皮下,验证其形成血管样结构的可行性。设计:对比观察。单位:原上海第二医科大学组织工程重点实验室。材料:实验于2002-01/06在上海第二医科大学组织工程重点实验室完成。新生婴儿脐带来源于本院妇产科健康新生儿,经产妇知情同意,实验经过医院伦理委员会的批准。选用26只3～4周龄清洁级裸鼠,雌雄不拘,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。聚羟基乙酸购自Albany International Research Co.。方法:将体外培养、扩增的新生婴儿脐静脉血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸材料上,形成细胞-材料复合物,将该复合物包绕于硅胶管使成管状结构后移植于20只裸鼠皮下为实验组,将未接种细胞的单纯聚羟基乙酸置入其余6只裸鼠皮下。主要观察指标:分别于细胞-生物材料复合物置入后第2,6周后取出两组移植物进行大体观察,并进行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色,检测VIII因子及α-平滑肌肌动蛋白的表达。结果:裸鼠26只均进入结果分析。①大体观察结果:移植物置入2周后,两组移植物均有管状结构形成;置入6周后,对照组管形结构消失,围绕硅胶管有极薄的纤维组织包裹形成,抽去硅胶管后,纤维组织失去支撑,无法维持管型结构。实验组抽去硅胶管后,新生组织仍维持管型结构。②组织学观察及免疫组化检测结果:移植物置入2周后,两组均可在镜下观察到大量未完全降解的聚羟基乙酸,对照组内少有细胞成分,实验组内可见多量细胞存在;置入6周后,两组聚羟基乙酸成分基本消失,对照组只有菲薄的纤维结缔组织形成,实验组显示有新生血管组织形成,其最内层有VIII因子阳性细胞覆盖,管壁内有大量细胞外基质及散在的α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞存在。结论:血管内皮细胞、平滑肌细胞-聚羟基乙酸复合物置入裸鼠皮下可形成具有与正常血管组织学结构相似的血管。

改良法分离大鼠IOUs构建小肠的初步研究

目的采用改良方法分离大鼠小肠上皮类器官单位(IOUs),鉴定IOUs裸鼠体内发育能力。方法取出生5～8d大鼠的小肠组织,采用改良分离法获得IOUs,与细胞外基质胶混合后植入裸鼠皮下,定期取材,组织学鉴定。结果采用改良方法分离时间明显缩短,体内植入所有实验组均有多个囊泡样组织形成,植入2周后部分囊腔凹陷可见隐窝样结构,2周后部分囊泡内壁可见分化较成熟的上皮细胞突出,类似绒毛结构;上皮下可见少量平滑肌样细胞围绕囊状管腔周围。结论初步证实改良方法分离出IOUs用于组织工程肠管构建的可行性,并为出生后组织修复重构的研究奠定了基础。

口腔扁平苔藓与鳞癌患者的T细胞免疫状态

作者检测了30例扁平苔藓、25例口腔鳞癌患者的T细胞亚群水平,并以15例健康人作对照。结果:健康人中 OKT_3 62.8土1.81,T_4 44.4土7.34,T_c 25.5土0.7l,T_4/T_81.79±0.13;扁平苔藓病员OKT值分别为:53.2土l.92,40.2士1.9,38.61土2.2,1.10土0.07,鳞癌患者分别为52.9土1.9,40.2土2.3,36.4土2.05,1.17土0.09;二组患者分别与健康人组比较,OKT_3、OKT_4/OKT_8均显著低于健康人(P<0.001),而OKT_8值明显高于健康人(P<0.001),提示:两组患者的T细胞免疫功能低下。

组织工程软骨体外构建的相关实验研究

目的探索组织工程软骨体外构建技术体系可行性。方法种子细胞选用胎儿软骨细胞(口服药物流产胎儿,胎龄3-6个月)。酶消化法获得第1代细胞,以50×106/ml浓度均匀接种于经聚乳酸(PLA)包埋聚乙醇酸(PGA)高分子聚合物支架,形成细胞-支架复合体,在体外静态培养。分别于2周、4周、8周进行大体观察、扫描电镜及组织学检测。结果体外构建的组织工程软骨,随培养时间延长,色泽由2周时的乳白色逐渐呈现半透明,8周时接近正常软骨外观。扫描电镜显示软骨细胞与材料具有良好相容性,培养7天PGA纤维之间有基质沉积。HE染色示2周有大量软骨陷窝形成和均匀嗜碱性基质分泌,Safranin’O染色示基质有酸性蛋白多糖分布,Massons’s trichome染色示基质有胶原成分,但含量较少,经免疫组织化学检测为特异Ⅱ型胶原。培养4周胶原成分开始明显增多,软骨陷窝形态接近成熟,8周细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量丰富且分布均匀。结论以成熟软骨细胞为种子细胞,运用组织工程技术在体外能构建出具有正常软骨组织结构特征的人组织工程软骨。

采用紧束缚格林函数法研究原子吸附石墨烯纳米带电子输运

采用紧束缚非平衡格林函数法分析了扶手椅型石墨烯纳米带(AGNR)和锯齿形石墨烯纳米带(ZGNR)器件吸附H、F、O和OH这4种原子的电子输运特性。用π电子结构体系的紧束缚理论分析了GNR的电子结构;用紧束缚扩展休克理论计算了GNR碳原子与所吸附原子间的电子相互作用;用非平衡格林函数法仿真了GNR吸附原子后的电流特性。研究结果表明:在平衡态下,AGNR吸附H原子后对器件的输运谱影响最大,而吸附OH原子后使GNR的禁带宽度增加0.3eV;在非平衡态下,吸附H原子不仅增加了导带底附近态密度,而且直接在禁带引入了杂质能级,从而提高了AGNR器件产生的电流;H原子吸附在ZGNR器件产生的电流约是吸附在AGNR电流的1.5倍;H原子吸附在GNR非边界处比吸附在边界处产生的电流高。该研究结果可以对提高石墨烯气敏传感器和生物传感器的灵敏度提供理论基础。

常年性变应性鼻炎sIL-2R的表达

目的探讨常年性变应性鼻炎 (PAR)患者中可溶性白介素 - 2受体 (sIL - 2R)的表达水平。 方法选择确诊为PAR者 47例为PAR组 ,正常体检者 36例为对照组。应用单抗、多抗双抗体夹心法检测sIL - 2R的表达水平。 结果PAR组患者的血清sIL - 2R水平呈高表达 ,较正常人群组显著性升高 (P <0 0 0 1) ,且无男女性别差异。 结论血清sIL -

老年口腔鳞癌病员免疫状态与预后关系的初步研究

本文对204例口腔鳞癌病员进行年龄分组,做DNGB皮试及T淋巴细胞亚群测定,并进一步随访观察预后。结果发现年龄90岁以上组的老年病员DNGB反应阳性率(38.7％)明显低于30～59岁组中的青年病员(63.6％)(P<0.01)。T细胞亚群测定老年组14例,中青年组10例,老年组辅助性T细胞(CD_4)明显低于中青年组(P<0.05)。随访196例病员,发现DNGB反应与预后有关,健在者的DNGB反应阳性率(58.4％)明显高于带瘤或死亡者(40.5％)(P<0.05)。但是,未发现年龄与预后有关。

FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中的表达

目的 研究FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤中表达的差异。方法 用免疫组织化学、Western -blot、流式细胞仪分析等方法检测FGFR1在增生性瘢痕和正常皮肤组织及相关细胞中的表达差异以及在成纤维细胞中的亚细胞分布状况。结果 FGFR1阳性细胞主要存在于角质形成细胞、汗腺、皮脂腺、血管内皮细胞及成纤维细胞等 ,细胞爬片观察到阳性颗粒主要位于细胞核 ,细胞浆中不如细胞核中明显。FGFR1在单个细胞中的表达量无明显差异。

小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为软骨样细胞的初步研究

目的 全反式维生素A酸(RA)联合转化生长因子-β1(TGF-β1)及骨形态发生蛋白-2(BMP2)等多种因子定向诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)分化,探索这几种细胞因子对ESC的成软骨定向诱导分化作用。方法 小鼠ESC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养扩增,在1×109mol/L全反式RA条件下制备拟胚体(EB),贴壁后联合应用TGF-β1及BMP2诱导分化,经形态学、免疫细胞化学和RT-PCR检测细胞性质。结果 ESC在悬浮培养下,经RA初步诱导后给予TGF-β1及BMP2等因子继续诱导,贴壁后EB周边可爬出多角形分化细胞,诱导分化细胞和EB表达Ⅱ型胶原和软骨发生早期特异性转录因子Scleraxis。结论 在RA预诱导EB分化后,TGF-β1和BMP2等因子可定向诱导小鼠ESC表达软骨特异性相关基因和蛋白,为胚胎干细胞成为软骨组织工程种子细胞提供了可能。

FasL基因转染Hela细胞体外诱导淋巴细胞凋亡的作用

目的 应用FasL基因转染具有上皮细胞特性的Hela细胞,探讨FasL基因的表达对诱导同种异体淋巴细胞凋亡的作用,为解决同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥问题提供一条研究途径。方法 PLNCX2-FasL质粒转化大肠杆菌,抽提纯化的PLNCX2-FasL质粒用限制性内切酶Xho Ⅰ,Not Ⅰ酶切,琼脂糖凝胶电泳得到755 bp大小的目的条带。紫外灯下切割回收目的条带并抽提纯化得到FasL基因,用Xho Ⅰ,Not Ⅰ酶切PCDNA3.1质粒载体并在相同位点插入FasL基因,T4酶连接,构建PCDNA3.1-FasL重组质粒。脂质体转染法将PCDNA3.1-FasL基因转染Hela细胞,G418筛选;经过免疫细胞化学法,RT-PCR鉴定后,进行单项淋巴细胞混合试验,检测FasL基因对诱导淋巴细胞凋亡的作用。结果 表达FasL基因的Hela细胞的淋巴细胞刺激指数较对照组转染空白质粒的Hela细胞下调,仅达到对照组刺激指数的17.01％。结论 FasL基因转染上皮细胞可诱导淋巴细胞凋亡,为研究避免同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥提供了一种可行的方法和设想。

TLR_4在人牙周膜成纤维细胞中的表达研究

目的:探讨TLR4在体外培养的人牙周膜成纤维细胞中的表达情况。方法:体外分离培养人牙周膜成纤维细胞,采用免疫荧光染色检测TLR4蛋白在该细胞中的表达;用半定量RT-PCR法检测TLR4基因的表达及0.1 ng/mL牙龈卟啉菌脂多糖刺激24 h后细胞内TLR4基因表达水平的改变。结果:免疫荧光检测显示体外培养的人牙周膜细胞中有TLR4表达,0.1 ng/mL牙龈卟啉菌脂多糖刺激24 h,其TLR4基因表达水平显著性增高(P<0.05)。结论:TLR4在牙周膜成纤维细胞中有表达,牙龈卟啉菌脂多糖成分可刺激TLR4基因上调,提示与该细胞参与牙周免疫应答有关。

Bio-oss胶原与骨髓基质细胞相容性的实验研究

目的:探讨Bio-oss胶原与骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的生物相容性,为用组织工程技术修复牙周缺损提供理论依据。方法:体外培养恒河猴BMSCs,将BMSCs与Bio-oss胶原复合进行体外培养。用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞与材料的黏附,MTT法检测细胞的增殖,并行碱性磷酸酶(ALP)活性测定。采用SAS6.12软件包对所得数据进行t检验。结果:BMSCs能黏附于Bio-oss胶原上;MTT结果显示,在2d、5d时,对照组和实验组间无显著性差异(P>0.05),8d时,两组间有显著性差异(P<0.05);在各时间点,对照组和实验组间ALP活性均无显著性差异(P>0.05)。结论:Bio-oss胶原与恒河猴BMSCs有良好的生物相容性,可作为组织工程材料应用于牙周骨缺损的修复。

骨髓间充质干细胞构建组织工程化肝脏组织模型

目的以骨髓间充质干细胞接种材料体外肝样细胞定向诱导后回植,修复肝脏巨大缺损的效果观察,从而探讨以骨髓间充质干细胞构建组织工程化肝脏组织的可行性。方法将第一代(P1)骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(polyglycolic acid/polylactid acid,PGA/PLA)支架材料上,经肝细胞生长因子(HGF)、20ng/mL,成纤维生长因子-4(FGF-4)10ng/mL及地塞米松40ng/mL体外联合诱导2周。通过绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,示踪回植于肝功能衰竭模型内的细胞转归。以单纯肝切模型为对照。术后8周取材,分别进行免疫组织化学、分子生物学检测,观察骨髓间充质干细胞与PGA/PLA支架材料的细胞材料复合物在大鼠肝脏修复中的作用。结果术后8周,PGA/PLA完全降解,新生肝脏组织生长,缺损肝脏基本恢复正常大小。病理学及免疫组织化学结果提示新生肝脏组织具有肝脏管腔样结构,能表达Alb和CK18,而AFP表达阴性,与对照组比较,差异无统计学意义。结论骨髓间充质干细胞在体外结合组织工程材料的定向诱导后回植有利于修复肝脏巨大缺损。