嵌合性抗ROR1抗体Fab片段的制备及鉴定

目的:构建嵌合性抗ROR1抗体Fab片段原核表达载体,初步探讨该抗体的生物学特性。方法:利用小鼠免疫和细胞融合,选取阳性克隆细胞株,在此基础上,运用基因工程技术扩增得到抗体轻链和重链,经酶切后与原核表达质粒pETDUET-1连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转入E.coli BL21中表达、纯化,SDS-PAGE、Western blot及ELISA对该抗体进行鉴定和分析,流式细胞术及免疫荧光初步检测该抗体与卵巢肿瘤细胞的特异性结合能力。结果:筛选出分泌抗ROR1抗体的杂交瘤单克隆细胞株,在此基础上,成功扩增抗体轻链和重链并构建嵌合性抗ROR1抗体Fab段原核表达载体,经检测证实抗ROR1抗体Fab段可与ROR1抗原和卵巢肿瘤细胞特异性结合。结论:初步验证嵌合性抗ROR1抗体Fab片段可与卵巢肿瘤细胞结合,为进一步探究抗体肿瘤靶向治疗奠定了基础。

全人源抗Trop-2 IgG的制备及对卵巢癌细胞生物特性的影响

目的 :构建全人源抗人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,Trop-2)抗体Ig G真核表达系统,表达并纯化该抗体,并检测其对卵巢癌细胞生物特性的影响。方法:构建全人源抗Trop-2抗体Ig G的重组表达载体;在293Free Style(293F)真核表达体系中表达并纯化该抗体。使用SDS-PAGE、ELISA、亲和力测定、免疫荧光等方法鉴定该抗体并分析其免疫学活性;使用cell counting kit-8(CCK-8)法、划痕实验、Transwell实验和细胞凋亡实验分析其对卵巢癌细胞特性的影响。结果:成功制备出全人源抗Trop-2 Ig G;经多种方法检测,该抗体能与Trop-2蛋白特异性结合;对表达Trop-2的卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡有明显影响。当抗体浓度为400μg/m L时,卵巢癌细胞HO8910的生存率仅为55.95%(P<0.01),划痕愈合率仅为24.71%(对照组为70.80%,P<0.01),侵袭细胞数是对照组的32.11%(P<0.05),细胞凋亡率是对照组的2倍(P<0.05)。结论 :全人源抗Trop-2 Ig G可特异性识别卵巢癌细胞表面的Trop-2蛋白,对卵巢癌细胞的恶性行为具有明显的抑制作用。因此,全人源抗Trop-2 Ig G在卵巢癌的靶向治疗中有潜在应用价值。

抗Trop-2 IgG抗体联合顺铂对卵巢癌细胞特性的影响

目的探讨抗Trop-2 IgG抗体联合顺铂对卵巢癌上皮细胞的影响。方法转染Trop-2质粒至293F细胞,利用Protein A亲和柱纯化,获得人源抗Trop-2 IgG抗体。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Trop-2质粒转染效率;聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)鉴定抗Trop-2 IgG抗体纯化效率;分子互作Biacore T100检测抗Trop-2 IgG抗体与Trop-2抗原的亲和力。蛋白免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光检测HO8910细胞和Iose 386细胞中Trop-2蛋白表达水平。实验分为4组:磷酸盐缓冲液(PBS)组、Trop-2 IgG组、cisplatin组、Trop-2 IgG+cisplatin组。CCK8检测卵巢癌细胞存活率,Transwell检测卵巢癌细胞迁移和侵袭能力。结果成功转染并纯化人源抗Trop-2 IgG抗体,并且其与Trop-2具有较高的结合力和免疫活性。抗Trop-2 IgG抗体在HO8910细胞中高表达,在Iose 386细胞中不表达。当顺铂存在时,Trop-2蛋白表达水平在HO8910细胞中高于Iose 386细胞,差异有统计学意义(P<0.05),并且Iose 386细胞中Trop-2蛋白表达水平不受影响。在HO8910细胞中,与PBS组相比,Trop-2组细胞存活率显著降低,且随着时间的增加,存活率逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与cisplatin组相比,Trop-2 IgG+cisplatin组中HO8910细胞和Iose 386细胞存活率都降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在HO8910细胞中,与PBS组相比,其余3组细胞迁移和侵袭能力降低,并且Trop-2 IgG+cisplatin组中迁移和侵袭细胞数量少于cisplatin组,差异均有统计学意义(P<0.05);而在Iose 386细胞中无效果。结论抗Trop-2 IgG联合顺铂后可特异性识别卵巢癌细胞表面的Trop-2抗原,且能加强顺铂对HO8910细胞的抑制效果,为卵巢癌抗体-药物偶联物的开发和靶向治疗提供了思路。