自由基介导兴奋性氨基酸对培养皮层神经细胞毒性的研究

本文在体外对新生大鼠（０～１ｄ）大脑皮层神经细胞进行原代培养的基础上，建立谷氨酸（Ｇｌｕ）对培养的皮层神经细胞兴奋毒损伤模型。通过检测乳酸脱氢酶释出率和形态学观察，证实了Ｇｌｕ对神经细胞存在兴奋毒作用。通过测定不同条件下Ｇｌｕ兴奋毒对培养的神经细胞造成损伤时细胞膜脂质过氧化物（ＬＰＯ）浓度，发现膜ＬＰＯ浓度与Ｇｌｕ剂量及作用时间紧密相关，表明Ｇｌｕ对神经细胞兴奋毒作用有自由基产生并介导了神经细胞的损伤。

脑缺血及再灌流期间生物膜磷脂代谢特点

本文利用大白鼠４血管结扎法建立脑缺血再灌流模型，同时制备脑组织线粒体和微粒体组分，检测假手术组，缺血１５ｍｉｎ，再灌ｌｈ、ｌｄ和３ｄ各组生物膜主要磷脂的含量变化，发现再灌流时磷脂代谢变化比缺血期幅度大，并且线粒体主要组成磷脂和微粒体主要组成磷脂代谢变化规律并不一致，证明磷脂代谢异常导致了生物膜功能丧失，造成了神经元的损伤。

瑞氏木霉表达黑曲霉葡萄糖氧化酶

利用高表达分泌纤维素酶的真菌瑞氏木霉表达重组的黑曲霉葡萄糖氧化酶。在大肠杆菌DH5α中构建瑞氏木霉纤维素酶CBHI启动子和CBHI信号肽基因黑曲霉葡萄糖氧化酶基因瑞氏木霉纤维素酶CBHI终止子构巢曲霉的甘油醛3磷酸脱氢酶启动子大肠杆菌抗潮霉素B磷酸转移酶基因构巢曲霉色氨酸C终止子pUC19(命名为pCBHGOD)质粒,线性化后用瑞氏木霉纤维素酶CBHI启动子和CBHI信号肽基因黑曲霉葡萄糖氧化酶基因瑞氏木霉纤维素酶CBHI终止子构巢曲霉的甘油醛3磷酸脱氢酶启动子大肠杆菌抗潮霉素B磷酸转移酶基因构巢曲霉色氨酸C终止子(命名为CBHGOD)核酸片段转化瑞氏木霉QM9414原生质体。用PCR扩增方法筛选出同源重组葡萄糖氧化酶基因的瑞士木霉突变株。用麦杆诱导瑞氏木霉突变株,生产黑曲霉葡萄糖氧化酶,Westernblot分析重组的葡萄糖氧化酶分子量与Sigma公司的天然黑曲霉葡萄糖氧化酶一致,生产的重组酶活性25umL,相当于Sigma公司葡萄糖氧化酶标准品的产量为0.5gL。瑞氏木霉可用于生产黑曲霉葡萄糖氧化酶。

应用活化mPEG5000修饰HCG及其活性研究

活化甲基聚乙二醇5000（mPEG5000）与高比活人绒毛膜促性腺素（HCG）纯品交联，利用放射受体测定法检测了修饰剂mPEG5000用量与HCG活性保留率的关系，并发现经mPEG5000修饰后HCG的活性稳定性增强，表现为对pH变化和胃蛋白酶破坏的耐受力增大，使之更适于临床使用。

胰高血糖素基因克隆、表达及鉴定

目的 研制基因工程胰高血糖素，用于治疗因注射胰岛素或口服抗糖尿病药物而引起的严重低血 糖反应。方法 依据人胰高血糖素氨基酸组成序列，采用大肠杆菌出现频率高的氨基酸密码子，体外合成胰高血 糖素基因序列，克隆于ｐＧＥＸ－１Ｎ质粒，转化人ＢＬ２１（ＤＥ３）菌中，对阳性克隆转化质粒进行ＤＮＡ测序。用ＩＰＴＧ诱导 转化的胰高血糖素工程菌，产生谷胱苷肽转移酶的融合蛋白，经谷胱苷肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析后，由 Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ酶 进行柱上切割，最后用ＲＰ－ＨＰＬＣ得到纯化产物。产品用质谱法测相对分子质量，并对Ｎ末端１５个氨基酸测序。 结果ＤＮＡ测序显示克隆基因序列正确，产品相对分子质量为３４８６Ｊ末端１５个氨基酸序列与理论值相同，产率为 １．９ｍｇ／Ｌ。结论 获得以可溶性融合蛋白方式表达的胰高血糖素基因工程菌，适于快速生产天然序列重组胰高血 糖素。

重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。方法提取Thermomonospora fusca基因组DNA作模板,PCR扩增纤维素酶Cel6A基因,克隆到毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,用电击法将线性Cel6A-pGAPZαA核酸片段转化毕赤酵母X-33株,克隆PCR鉴定法筛选阳性转化株,培养传代。选择稳定株,培养3d后取培养液上清,用His-BindQuick Cartridge300提取表达的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。结果一步His-Bind Quick Cartridge300层析可提取电泳纯的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A,SDS-PAGE分析显示相对分子质量约为60000,收率为200mg/L,用羧甲基纤维素法测活性为500U/mg,用滤纸法测活性为1U/mg。结论已在毕赤酵母中成功表达了Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。

兴奋毒作用下皮层神经细胞Ca^(2+)变化机制

目的 检测谷氨酸兴奋毒损伤时 ,在胞外有 Ca2 +或无 Ca2 + ,或有尼莫地平和 Ca2 +条件下 ,神经细胞内〔Ca2 +〕i的变化。方法 用Fura- 2 / AM体外检测新生大鼠皮层神经细胞胞内游离钙离子浓度的方法。结果 发现谷氨酸兴奋毒可使皮层神经细胞〔Ca2 + 〕i上升并有剂量依赖性 ,胞外无 Ca2 +或加入尼莫地平时神经细胞〔Ca2 +〕i虽也上升 ,但幅度降低 ;三种条件下神经细胞在兴奋毒作用下〔Ca2 +〕i变化各不相同。结论 表明谷氨酸活化神经细胞膜上受体 ,使胞内钙库动员和细胞膜 Ca2 +通道开放 ,导致〔Ca2 +〕i在短时间内总体表现为持续上升。存在兴奋毒损伤过程中有磷脂酶 A2 活化过度参与的信使基础。

缺血及再灌流时不同脑区磷脂酶A_2活性的变化及作用探讨

本文利用大鼠４血管阻断法（４ＶＯ）建立脑缺血再灌流模型，分别检测假手术组，缺血１５ｍｉｎ组，缺血１５ｍｉｎ后再灌流１ｈ、６ｈ、２４ｈ、７２ｈ和１６８ｈ各组不同脑区的磷脂酶Ａ_２（ＰＬＡ_２）活性变化。发现海马和皮质下脑区ＰＬＡ_２活性在再灌流早期显著升高，但随再灌流时间延长其活性反而低于假手术组；而皮质区ＰＬＡ_２活性在再灌流早期虽然也升高，但很快接近假手术组。表明ＰＬＡ_２活性改变有着区域性差别，参与并影响了缺血再灌流后选择性神经元坏死的病理过程。

人绒毛膜促性腺素放射受体法的建立及其片段受体结合能力的研究

在获得高比活人绒毛膜促性腺素纯品的基础上，建立了检测人绒毛膜促性腺素的放射受体测定法。利用CNBr和TPCK—胰蛋白酶分别切割人绒毛膜促性腺素，用高压液相层析分离各种片段并检测其受体结合能力，发现特殊的绒毛膜促性腺素片段仍保留部分与受体结合的能力。这为研制封闭受体避孕药奠定了基础。

大鼠缺血及再灌注过程中脑组织磷脂酶A_2作用的实验研究

利用Ｗｉｓｔａｒ大鼠四血管结扎法建立脑缺血及再灌注模型，改进了一种简便快速测定组织磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）活性的方法；分别测定假手术组，缺血１５ｍｉｎ组，缺血１５ｍｉｎ再灌注１ｂ，６ｈ、１ｄ、３ｄ和７ｄ各组脑组织ＰＬＡ２活性变化．发现在脑缺血及再灌注早期时ＰＬＡ２活性显著增加，但随再灌注时间延续逐渐又接近对照组水平，证明ＰＬＡ２参与了脑缺血再灌注损伤的形成。

^(21)Ala定点突变胰高血糖素及结构与功能变化

胰高血糖素是由 2 9个氨基酸组成的多肽激素 ,具有促糖元分解的生理功能 ,其拮抗剂有治疗糖尿病病人的潜在应用价值 .在获得重组胰高血糖素基因工程菌基础上 ,利用定点突变技术改造其第 2 1位氨基酸天冬氨酸为丙氨酸 ,并经DNA测序证明胰高血糖素基因发生了点突变 .用IPTG诱导表达后 ,经亲和层析和反相高效液相层析 ,纯化到突变型重组2 1Ala 胰高血糖素 .质谱测定分子量与理论值相符 .利用园二色谱比较重组胰高血糖素和突变的2 1Ala 胰高血糖素在TFE中的二级结构 ,发现胰高血糖素以α螺旋为主要二级结构 ,2 1Ala 胰高血糖素仍有α螺旋结构特征 ,并且含量有所增大 .利用兔升血糖试验 ,发现2 1Ala 胰高血糖素生物活性比重组胰高血糖素减少 51 % (P <0 .0 1 ) .显示天然胰高血糖素第 2 1位氨基酸天冬氨酸与形成α螺旋结构关系不大 ,但在发挥胰高血糖素的生物功能中有重要作用 ,与其可作为钙离子结合位点 ,参与胰高血糖素和受体结合的潜在功能密切相关 .

应用pCYB1载体表达胰高血糖素

目的 研制基因工程胰高血糖素。方法 利用pCYB1表达载体,亚克隆胰高血糖素基因后转化于BL21（DE3）菌种,并对阳性克隆的质粒进行DNA测序。检测不同条件下,IPTG诱导胰高血糖素-intein-几丁质结合结构域（CBD）组成的融合蛋白表达量,确定工程菌表达最适条件。利用几丁质结合柱进行亲和层析,在DTT作用下由intein在柱上进行自我切割,纯化胰高血糖素。SDS-PAGE检测融合蛋白表达量,SDS-PAGE在Tris-Tricine缓冲系统中电泳检测纯度,Lowry法检测蛋白质含量,Western blot检测免疫原性,升血糖实验检测活性并进行 N-末端测序。结果DNA测序显示表达产物基因序列正确,纯化胰高血糖素具有免疫原性和生物学活性,N-端15个氨基酸与天然产品相同,电泳呈单一谱带,产率为1.25mg/L。结论 获得分泌胰高血糖素基因工程菌,适于快速大规模生产。

迟发性神经元死亡以凋亡形式发生的研究进展

本文依据细胞凋亡的概念和特点,分别从脑缺血再灌流损伤动物模型研究迟发性神经元死亡中的研究的角度,从凋亡相关基因在迟发性神经元死亡中的研究的角度,从迟发性神经元死亡过程中存在凋亡刺激因子的角度,综述了将迟发性神经元死亡与细胞凋亡相结合进行研究的主要进展。

红景天甙对培养大鼠皮层神经细胞O_2~ . ^-和H_2O_2损伤的保护作用

在体外对新生大鼠（０～１ｄ）大脑皮层神经细胞进行原代培养的基础上，利用超氧阴离子（Ｏ２．－）自由基和Ｈ２Ｏ２损伤模型，研究红景天甙（Ｓａｌ）对神经细胞自由基损伤的保护作用。通过检测乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）释放量和细胞存活率，以及形态学观察，证实红景天甙对大鼠皮层神经细胞的自由基损伤确有保护作用。

大鼠可逆性全脑缺血再灌流过程中几个脑区磷脂含量及组分的变化

应用高效液相色谱－紫外检测技术检测了大鼠全脑缺血１５ｍｉｎ及再灌流１ｈ～７ｄ海马、皮层下（丘脑和纹状体）、新皮层突触体（Ｚａｌｅｓｋａ方法）主要磷脂组分含量变化。结果显示，短暂缺血再灌流后各脑区存在着磷脂代谢的异常，再灌流期磷脂的降解甚于缺血期。磷脂组分中以ＰＥ、ＰＣ的减少为著，在ＰＥ、ＰＣ显著减少时也存在ＰＳ的减少；而ＳＭ无明显减少，随再灌流的延长有升高趋势。３个脑区磷脂含量的减少存在差别，反映了激动剂依赖性磷脂降解以及Ｃａ￣２＋依赖性磷脂酶活化的区域性，是选择性神经元损伤的生化基础。ＰＣ／ＳＭ比值的缩小可能更敏感地提示了膜损害或修复过程中膜结构的变化。

甲基聚乙二醇修饰HCG后对表位的影响

采用活化酯法用甲基聚乙二醇(mPEG)对高比活的人绒毛膜促性腺素(HCG)纯品进行化学修饰,利用放射免疫测定法研究了HCG结合mPEG后对HCG免疫反应性的影响,发现mPEG对HCG的修饰位点结合可影响抗体对抗原表位的识别结合,间接证明mPEG-HCG比天然HCG降低了免疫原性。

大鼠可逆性全脑缺血再灌注过程中几个脑区磷脂含量及组分的变化

应用高效液相色谱－紫外检测技术检测了大鼠全脑缺血１５ｍｉｎ及再灌注１ｈ～７ｄ海马、皮层下（丘脑和纹状体）、新皮层突触体（Ｚａｌｅｓｋａ方法）主要磷脂组分含量变化。结果显示，短暂缺血再灌注后各脑区存在着磷脂代谢的异常，再灌注期磷脂的降解甚于缺血期。磷脂组分中以ＰＥ、ＰＣ的减少为著，在ＰＥ、ＰＣ显著减少时，也存在ＰＳ的减少；而ＳＭ无明显减少，随再灌注的延长有升高趋势。三个脑区磷脂含量的减少存在差别，反映了激动剂依赖性磷脂降解以及Ｃａ２＋依赖性磷脂酶活化的区域性，是选择性神经元损伤的生化基础。

重组Thermus thermophilus DNA聚合酶表达纯化及其在RT-PCR中的应用

目的研究重组ThermusthermophilusDNA聚合酶的表达、纯化和应用。方法提取Thermusthermophilushb8基因组DNA作为模板,PCR扩增TthDNA聚合酶基因后,克隆至pET28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用His-BindQuickCartridge300纯化重组TthDNA聚合酶His-tag融合蛋白。提取Thermomonosporafusca总RNA,用一管法RT-PCR扩增E2cd基因,检测重组TthDNA聚合酶RT-PCR活性。结果大肠杆菌表达TthDNA聚合酶,分离出的电泳纯重组TthDNA聚合酶His-tag融合蛋白相对分子质量为94000,表达产量为200000U/L。一管法RT-PCR可扩增出850bp长度的E2cd基因。结论重组TthDNA聚合酶已成功地表达和纯化,并用于RT-PCR。

卒中后脑缺血再灌流损伤的磷脂酶A_2调控机制

磷脂酶A_2主要水解磷脂Sn-2位脂酰键释放花生四烯酸等。本文综述了PLA_2存在形态的多样性;及PLA_2活化调控因素分别为磷脂存在状态及结构组成,Ca^(2+),G蛋白,蛋白激酶C及cAMP的依据;介绍了PLA_2催化反应的主要产物花生四烯酸的主要作用。最后结合作者的研究结果,提出了PLA_2活化在老年常见病卒中后脑缺血再灌流损伤中的作用机制。