2013—2021年云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行与混合感染状况调查

【目的】调查云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行规律和混合感染情况。【方法】采用分子生物学方法对2013—2021年间的3112份血液样品进行PRRSV核酸检测,并进一步分析其流行和混合感染情况。【结果】检测样品中,有801份样品为PPRSV阳性,阳性率为25.74%,二重、三重和四重混合感染率分别为41.20%、12.48%和1.87%;不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大,生长育肥猪感染最严重(33.24%);相对于育肥场和散养户,种猪场的感染程度较轻,三者的感染率分别为27.94%、28.94%和14.29%。对不同毒株类型分析发现:高致病性毒株和经典毒株仍是主要的流行毒株,分别占毒株数的58.49%和22.64%,但占比呈逐年下降趋势。于2019年和2021年在云南省内分别发现了类NADC30毒株和类NADC34毒株,分别占毒株数的15.09%和3.77%,其感染率呈逐渐上升趋势。【结论】猪繁殖与呼吸综合征仍是影响云南省生猪产业健康发展最重要的疫病之一,表现形式以和其他疾病混合感染为主。随着新毒株的发现,云南省PRRSV基因更加多样,防控形势愈加复杂。

云南省部分地区猪感染BVDV流行病学调查

为了解云南省部分地区猪感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的情况,对来自散养户和规模猪场的211份不同年龄段粪便样品进行RT-PCR分子生物学鉴定。结果显示,散养户和规模猪场的BVDV阳性率分别为16.67%和5.83%,哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和种母猪样品阳性率分别为7.58%、20.83%、11.76%和0,总阳性率为11.37%,表明云南省普遍存在猪感染BVDV情况。该研究结果为多种家畜混养情况下的BVDV防控提供了理论依据,今后应当提高BVDV与猪瘟病毒(CSFV)二者混合感染检测及其防控的意识。

云南省部分地区猪衣原体感染的血清学调查

为了解云南省猪衣原体病流行情况,采用间接血凝试验对采自云南省部分地区规模化猪场及散养户猪只血清共1 257份,进行猪衣原体感染的血清流行病学调查。结果表明,共检出阳性血清232份,阳性率为18.5%。其中,采自规模猪场的956份样品中,阳性193份,阳性率为20.2%;其中母猪样品132份,阳性38份,阳性率为28.8%,育肥猪样品824份,阳性155份,阳性率为18.8%。农户散养户301份样品,阳性39份,阳性率为13%;其中母猪样品53份,检出11份阳性,阳性率20.8%,育肥猪样品248份,阳性28份,阳性率11.3%。表明猪衣原体病在云南省呈流行趋势。

2009年—2013年云南省楚雄地区猪伪狂犬病血清流行病学调查和防控措施研究

为了解楚雄地区猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染状况,通过gE-ELISA方法对采集自楚雄地区2009年-2013年间累计2 811份血清进行了PRV野毒感染抗体检测,对4个规模养殖场猪场采取了疫病净化控制措施。共计检测场(户)数758户,总阳性率为31.70%;其中商品猪阳性率为26.34%,种猪阳性率为35.06%;规模场样本阳性率为37.67%;散养农户样本阳性率为28.62%;没有接种疫苗的母猪阳性率(56.82%)高于每年分别免疫接种1次(45.16%)、免疫接种2次(29.41%)和免疫接种3次(18.33%)的母猪阳性率。采取控制措施12个月后,4个试验猪场相对于对照猪场阳性率均明显下降。提示了猪伪狂犬病病毒普遍存在于楚雄地区养猪场,完善生物安全措施,制定合理的防疫制度,使用基因缺失疫苗配合检测、淘汰阳性猪是规模猪场控制该病进一步扩散的有效方式。

一株犬细小病毒云南毒株生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒云南地方毒株的生物学特性,本试验将疑似病犬粪便经处理后接种于F81细胞,逐日观察病毒致细胞病变效应（CPE）,对能引起细胞出现CPE的培养物进行病毒粒子电镜观察和分子生物学检测;在此基础上,完成分离病毒的部分生物学特性分析。结果表明,分离物在F81细胞盲传3代后开始出现拉网,脱落,崩解和破碎等CPE现象;电镜下可见病毒粒子呈圆形或六边形,无囊膜,直径约为20 nm;PCR检测出现目的条带,序列分析结果显示该毒株序列和犬细小病毒参考毒株核酸同源性为98.8%-99.7%。该毒株在生物学特性上除具有一般犬细小病毒相关特性外,还表现出异步接毒可致F81细胞出现明显CPE及能凝集食蟹猴红细胞的特性。基于VP2基因序列分析显示分离株基因型为新CPV-2a型,部分有生物学意义位点发生突变,亲缘关系与国内参考毒株关系较远,而与韩国参考毒株亲缘关系较近。提示,本试验成功分离获得一株犬细小病毒云南地方流行毒株,命名为YNX20090901株。

楚雄州2012～2014年6种猪繁殖障碍性疫病的血清流行病学调查

[目的]了解楚雄州猪繁殖障碍性疫病的流行情况。[方法]采用血清学方法调查了楚雄州2012~2014年6种猪繁殖障碍性疫病的感染情况。[结果]楚雄州猪圆环Ⅱ型病毒病总阳性率达到89.41%,猪伪狂犬病总阳性率达到47.00%,猪细小病毒病阳总性率达到47.46%,猪乙型脑炎病总阳性率达到49.39%,猪衣原体病总阳性率达到24.36%,猪弓形虫病总阳性率达到23.98%。[结论]6种繁殖障碍性疫病广泛存在于楚雄州,此调查结果为控制繁殖障碍性疫病的流行提供了一定的参考依据。

蜡梅枝叶化学成分及其抗病毒活性

利用各种色谱技术从蜡梅枝叶中共分离得到10个化合物,通过波谱学方法将其鉴定为(+)-Calycan-thine(1)、(-)-Folicanthine(2)、(-)-Chimonanthine(3)、异秦皮啶(4)、3,3'-双异秦皮啶(5)、Euoniside(6)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(7)、3,4-二羟基苯乙腈(8)、Di-O-methylcrenatin(9)和Acanthoside B(10)。化合物4～10为首次从该植物中发现。采用细胞病变效应法测试了化合物1～5与8对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制活性,化合物2(IC50=58.9±10.2μM;TI=19.3)、3(IC50=68.9±3.1μM;TI=17.9)与8(IC50=80.5±16.9μM;TI>19.9)显示出了弱的抑制活性。

猪肺炎支原体YN200901株的分离鉴定

采集疑似猪肺炎支原体病理变化的肺脏,接种到改良牛心培养基、猪胃消化液培养基进行培养,经瑞特染色、镜检,菌落狄氏染色、PCR鉴定及序列比对、生化试验鉴定,抗猪肺炎支原体血清生长抑制试验,分离获得一株猪肺炎支原体云南地方流行菌株,命名为YN200901。试验结果为云南本地株猪肺炎支原体的后续研究提供了物质基础。

链球菌的分离鉴定及药敏试验

为分离和鉴定疑似链球菌感染病料,该试验采用革兰氏阳性菌选择性培养基进行分离培养,并进行生化试验鉴定及药敏试验。结果表明:6份病料中分离出6株链球菌菌株,根据生化试验鉴定表推断出,有4株为C群,1株为D群,1株为E群。药敏试验结果表明,先锋必和青霉素对链球菌有较好的抑制作用,此结果为链球菌病的研究和防治提供一定的理论依据。

抗原浓缩纯化工艺降低口蹄疫O型和Asia 1型二价灭活疫苗免疫副反应研究

为降低口蹄疫O型和Asia 1型二价灭活疫苗使用过程中存在的免疫副反应,本研究采用超滤技术对抗原进行浓缩纯化处理,制备浓缩抗原疫苗,通过测定制苗用病毒液LD50值和浓缩抗原疫苗内毒素含量,进行牛副反应试验,并与未浓缩的普通疫苗进行比较。结果表明,制苗用Asia 1/JSL06株和OS/99株病毒液经浓缩纯化处理后LD50值比常规处理LD50分别提高了1.0和1.25个滴度,内毒素值显著低于普通灭活苗内毒素值(p<0.01),接种本动物后未出现免疫副反应。本研究结果表明,使用超滤技术浓缩纯化抗原可有效降低口蹄疫灭活苗免疫副反应。

猪Mx1基因cDNA的克隆及序列分析

为获得云南本地猪Mx1基因cDNA序列,根据GenBank中猪Mx1基因的参考序列,设计合成3对引物。以云南本地猪外周淋巴细胞为样本,采用RT-PCR方法进行分段扩增,对扩增片段进行克隆,测序分析及序列拼接。结果表明,扩增的云南本地猪Mx1基因cDNA全长2 546 bp,开放阅读框1 992 bp,编码663个氨基酸,与GenBank中他猪种Mx1基因序列对比,核苷酸序列的同源性为99.4%～99.8%,氨基酸序列的同源性为98.8%～99.5%。成功获得云南本地猪Mx1基因的cDNA序列,为研究云南本地猪Mx1蛋白的抗病毒活性及作用机制奠定了基础。

天然中草药提取物抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究

为研究天然中草药对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗病毒活性,本研究以体外细胞培养体系为模型,在采用CCK-8法测定青黛(Indigo naturalis)、花椒(Zanthoxylum bungeanum)、卫矛(Euonymus ala-tus)和沉香(Aquilaria agallocha Roxb.)4种中草药提取物对细胞的半数毒性浓度(TC50)及最大无毒浓度(TC0)基础上,通过观察细胞病变效应(CPE),实时荧光定量RT-PCR方法检测病毒核蛋白基因(ORF7)mRNA表达量的变化,对天然中草药提取物抑制PRRSV增殖能力进行评价。实验结果分析显示:青黛、花椒、卫矛和沉香4种不同提取物的药物抗病毒选择指数(SI)分别为10.3,5.2,12.7,6。实时荧光检测病毒基因mRNA表达量变化结果表明:这4种天然中草药提取物在一定浓度范围内均能显著(P<0.05)抑制病毒NP蛋白基因(ORF7)的表达。本次研究结果证实,4种受试中草药提取物对PRRSV的增殖均具有显著(P<0.05)的抑制效果,以卫矛提取物的效果最佳。

云南省犬细小病毒VP2基因检测分析

为了解云南省犬细小病毒VP2基因分子流行变异情况,对来源于云南省7个地级市13个犬细小病毒样品进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与相关参考序列进行了遗传进化比对分析。结果表明,13个样品中9个基因型为CPV-2a,3个基因型为CPV-2b,1个基因型为CPV-2。氨基酸序列变异主要集中在297位-518位氨基酸处,其中324位和440位氨基酸变异在犬细小病毒进化过程中扮演着重要角色。遗传进化分析显示10个样品序列形成了一个相对于国内外参考序列独立的遗传进化分支,提示云南省犬细小病毒以CPV-2a基因型流行为主。

中草药复方制剂对禽新城疫及禽流感H_5亚型免疫抗体水平的影响

[目的]探讨中草药复方制剂对禽新城疫及禽流感H5亚型免疫抗体水平的影响。[方法]通过测定中草药复方饲料添加剂对免疫禽新城疫及禽流感疫苗的鸡血清抗体水平,评价天然中草药饲料添加剂的使用价值,筛选最佳剂量。[结果]复方制剂I号和复方制剂Ⅱ号均能显著提高新城疫、禽流感的免疫抗体水平(P<0.05),其中复方制剂I号效果优于复方制剂Ⅱ号(P<0.05)。复方制剂I号能够有效延长新城疫、禽流感免疫抗体消长水平,其中中等剂量组(0.50 ml/kg)效果最佳。[结论]该研究可为中草药复方饲料添加剂的开发为提供一定的理论依据。

曲靖地区仔猪腹泻细菌性病原的分离鉴定与耐药性分析

为了解曲靖地区仔猪出现腹泻的细菌性病因,对5个养殖场148份出现仔猪腹泻症状的样品进行细菌分离培养及耐药性分析,结果显示,检出致病性大肠杆菌(E.coli)114份,阳性率为77.03%;沙门氏菌(Salmonella)26份,阳性率为17.57%,混合感染率为17.57%。致病性大肠杆菌和沙门氏菌对多种抗生素产生了耐药性,其中114株致病性大肠杆菌中97株呈多重耐药性,占总菌数的85.09%,26株沙门氏菌中20株呈多重耐药性,占总菌数的76.92%。结果表明,致病性大肠杆菌是导致当地哺乳仔猪腹泻的主要细菌性病原,部分仔猪继发感染沙门氏菌,两种细菌对多种抗生素产生了耐药性,多重耐药现象较严重。

山羊源伪狂犬病病毒的分离与鉴定

为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒,采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测,并将病料接种至PK-15细胞分离病毒,以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明,PCR检测结果 PRV阳性,病料接种PK-15细胞24h后,细胞开始出现细胞病变;将病毒感染小鼠,36h后小鼠出现局部奇痒、死亡;gD基因序列分析发现,分离毒株与GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98%以上,氨基酸同源性在99%以上;在分离毒株gD基因的808bp^837bp位置上存在缺失与变异、高变重复区。本研究成功分离获得一株羊源伪狂犬病毒,为云南省羊伪狂犬病防控和基础研究提供资料。

云南省牛病毒性腹泻—黏膜病血清流行病学调查

[目的]牛病毒性腹泻—黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD)引起牛腹泻、呼吸系统疾病、生殖功能障碍、免疫抑制、母畜流产、死胎等,对牛产业发展危害严重。牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVDV)在我国大部分牛群中普遍存在,各地流行情况严重程度不同,本调查旨在调查云南省BVDV的流行情况。[方法]调查通过采用商品化的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对BVDV感染和流行情况进行调查,采集了云南省4个州10个县(市)的部分规模牛场及散养户的牛血清样品456份。[结果]结果发现,云南省不同地区所检的牛血清样品总抗体阳性率为16.45%(75/456),抗原阳性率为0.53%(2/378),其中抗体阳性率以大理州洱源县60.0%(9/15)最高,而丽江市华坪县的血清样品中未检测到抗体阳性,大理州宾川县和丽江市宁蒗县的抗原阳性率较低,分别为7.69%(1/13)和4.00%(1/25)。云南省规模场牛的血清样品抗体总阳性率为27.27%(45/165),抗原阳性率为1.15%(1/87),散养户牛的分别为10.31%(30/291)和0.34%(1/291)。[结论]云南省的牛群中存在着BVDV感染的情况,其抗体抗原的阳性率水平跟地区有着紧密的联系,不同的养殖方式抗原抗体水平存在着一定差异,必须要加强云南省BVDV监测与防控,减少其造成的经济损失。

云南省猪场猪呼吸道疾病综合征主要病原调查分析

【目的】猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)是引发猪场经济损失的重要原因之一,分析2016—2017年云南省部分地区规模化猪场及散养户间猪呼吸道疾病综合征(PRDC)主要病原的混合感染状况。【方法】通过PCR或RT-PCR对送检病料的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪肺炎支原体(MH)、传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)和副猪嗜血杆菌(HPS)7种主要病毒性或细菌性病原进行检测。【结果】406份送检样品中,359份为阳性,检出率为88.42%。所检样品中,既有单一携带的,又有混合感染的,PCV2阳性率最高(59.00%);APP阳性率最低(9.09%)。而混合感染以PCV2+PRRSV感染率最高(9.19%),其次为CSFV+PRRSV,感染率为4.46%,PRRSV+PRV和PCV2+MH感染率最低,二者都为0.56%;发现有三重和五重混合感染,以PCV2+CSFV+PRRSV三重感染率最高(2.51%),PCV2+PRRSV+PRV感染率最低(0.28%),CSFV+PRRSV+PCV2+APP+HPS五重感染率为0.28%;未发现四重感染。【结论】PRDC感染情况在云南省广泛存在,且致病病原复杂,所以应加强PRDC感染情况的监测以更有效地防控地方猪疫病发生。

猪流行性腹泻病毒云南流行毒株分离与鉴定

为有效控制和预防猪流行性腹泻(PED),分离获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)云南地方流行毒株,并选取部分经RT-PCR鉴定为阳性的样品,处理后接种在Vero细胞中进行分离培养,细胞培养物盲传至15代后可观察到典型的细胞病变(CPE),对细胞培养物通过RT-qPCR方法检测和间接免疫荧光(IFA)鉴定,并对分离株S基因全序列进行克隆和遗传进化分析。结果表明:获得的细胞培养物均为PEDV阳性,病毒半数细胞感染量(TCID_(50))为10^(-4.85)/0.1mL,将其命名为YNDH-2017毒株。该分离株S基因与参考毒株的同源性为92.8%～98.2%,和国内近年来PEDV流行毒株亲缘关系较近,存在相同的突变位点,而与经典毒株CV777株在两个大的分支上,亲缘关系较远。试验分离获得的YNDH-2017株属于当前国内流行毒株。

云南省新发猪圆环病毒3型感染状况调查与全基因进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在云南省不同地区猪群中的流行情况,针对PCV3基因保守区域设计特异性引物,优化反应条件,建立PCR快速检测方法,并采用该方法对采自云南省不同地市431份样品进行检测,将获得的部分毒株全基因序列进行遗传进化分析。结果显示:本研究成功建立了一种快速、特异和灵敏的PCV3检测方法;云南省12个地(市)29县(区)中,8个地(市)12个县(区)检测出阳性样品;431份样品中有43份PCV3阳性样品,阳性率为9.98%;获得的3株PCV3全基因组序列与参考毒株之间的核苷酸同源性为98.6%~99.5%,进化树显示3株云南毒株形成一个小的进化分支,属于PCV3a基因型。本研究结果表明,PCV3在云南省多个地区呈一定的流行趋势,流行毒株以PCV3a基因型为主,有必要进一步开展云南地区PCV3流行病学调查,并提出防控对策。