松江鲈(Trachiderm usfasciatus)髓样分化因子MyD88基因克隆与组织表达分析

髓样分化因子(My D88)是TOLL样受体介导的信号通路中的一个关键接头分子,通过激活核转录因子(nuclear factor-kappa B,NF-κB)而参与机体的先天免疫。克隆了松江鲈的My D88基因(命名为Tf My D88),并对该基因进行了生物信息学和表达模式分析。结果显示,Tf My D88 c DNA序列全长1 555 bp,5'UTR长89 bp,3'UTR长599 bp;开放阅读框长度为867 bp,编码288个氨基酸。SMART软件预测Tf My D88分子的N端为一个保守的死亡结构域(death domain,DD),C端存在典型的TIR(Toll/interleukin-1 receptor)结构域。Tf My D88与其它脊椎动物My D88的氨基酸相似性达57.58%-82.64%,系统进化树分析表明Tf My D88与同属鲈形总目的花鲈和鳜鱼聚在一起,所有鱼类My D88聚为一支。Real-time PCR检测显示Tf My D88广泛表达于松江鲈各组织,但在鳃中的相对表达量最高;其次为脾脏和皮肤。LPS(lipopolysaccharide)刺激后,Tf My D88在松江鲈的血液、肝脏、皮肤、脾脏均出现明显上调。刺激2 h后,在血液Tf My D88表达量升高了近60倍,在皮肤中的表达量也升高了27倍。上述结果表明Tf My D88可能参与松江鲈先天免疫。

松江鲈(Trachidermus fasciatus)泛素结合酶E2-D2基因的分子克隆及组织表达分析

泛素结合酶(UbcE2)是蛋白泛素化过程中所必需的酶,在泛素转移和底物的特异性识别方面发挥着重要的作用。本实验利用RACE技术克隆获得了全长为993bp的松江鲈泛素结合酶E2-D2基因cDNA序列(命名为TfUbcE2-D2),其开放阅读框为444bp,编码147个氨基酸。通过SMART预测得知,TfUbcE2-D2含有一个UBCc结构域。同源比对结果表明该基因与其他物种的同源性为92.31%。实时荧光定量PCR显示,TfUbcE2-D2广泛表达于松江鲈各组织,在肾脏中的相对表达量最高,其次为鳃。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后,TfUbcE2-D2在血液、脾脏、肝脏和鳃中表达均上调,其中,脾脏和鳃中的表达量上调约40倍。由以上实验结果推测,TfUbcE2-D2可能参与松江鲈的先天免疫防御。

松江鲈(Trachidermus fasciatus)凝血因子Ⅺ的基因克隆与表达分析

克隆松江鲈凝血因子XI基因cDNA序列,分析表达模式。利用RACE技术从松江鲈中克隆获得了凝血因子XI的cDNA全长序列(命名为TfXI),并对其进行生物信息学和表达模式分析。获得TfXI cDNA全长1 287 bp,包括13 bp的5'端非编码区,1 143 bp的开放阅读框以及131 bp的3'端非编码区。开放阅读框编码280个氨基酸的多肽链,预测的蛋白大小为42.9 kD。N端含有由第22-105位氨基酸,112-196位氨基酸、205-279位氨基酸和289-369位氨基酸形成的4个串联排列的典型APPLE结构域。NCBI Blast结果显示TfXI与其他物种凝血因子XI的相似性为30%-63%,进化树分析显示,TfXI符合传统进化规律。Realtime PCR分析表明,经LPS刺激96 h后,松江鲈脾脏TfXI表达量明显提高(P<0.01)。