【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second larges...【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second largest follicle at predeviation,PDF2),构建RNA文库后Illumina平台测序,经数据库比对,设定参数筛选高表达基因、差异表达基因并进行GO分析,Genecards基因功能查询进一步筛选与卵泡发育直接相关的调控基因,q RT-PCR对筛选的基因进行表达量验证分析。【结果】两个转录本中共获得263个差异表达基因;GO功能聚类分析共分为三大类90组:其中生物学过程占64.4%,细胞组分占17.8%,分子功能占17.8%;获得一些重要的功能富集通路,如调控信号转导和细胞因子应答的生物途径;基因表达量分析筛选出10个高表达的上调和下调基因,获得参与雌激素合成和胎儿性别发育的CYP17A1、参与类固醇激素合成的LOC785462、细胞发育过程中调节细胞凋亡的DACH1以及调节ERK和MEK1/2信号通路的MAP3K3。Genecards功能查询共获得6个基因与卵泡发育关系较为密切,其中上调基因分别为PRSS35,PTGRF,ARID4B,GPR116;下调基因为APOA1和CPXM1;q RT-PCR结果显示,PRSS35和ARID4B在DF中的表达量显著高于SF(P<0.05),CPXM1在SF中的表达量极显著高于DF(P<0.01),PTGRF,GPR116和APOA1在DF和SF中的表达量不存在显著差异(P>0.05),但其表达变化趋势与高通量测序结果相一致。【结论】转录组测序结果真实可靠,PRSS35和ARID4B在卵泡发育过程中发挥正调控作用,CPXM1在卵泡发育过程中发挥负调控作用,获得的牛卵泡发育相关基因和重要调节途径,对后期深入探讨卵泡发育调控机理的研究具有重要意义。展开更多
旨在筛选牛卵泡发育相关基因及其表达模式。本研究选取9头青年母牛,同期发情处理后,采集卵泡波中出现偏差前的小卵泡PDF2(The small follicle at onset of predeviation)和出现偏差后的最大卵泡ODF1(The largest follicle at onset of d...旨在筛选牛卵泡发育相关基因及其表达模式。本研究选取9头青年母牛,同期发情处理后,采集卵泡波中出现偏差前的小卵泡PDF2(The small follicle at onset of predeviation)和出现偏差后的最大卵泡ODF1(The largest follicle at onset of deviation),分离颗粒细胞(Granulesa cells,GCs),提取总RNA,并进行转录组测序;经牛RefSeq数据库搜索和差异表达基因筛选,进行GO(Gene ontology)分析;随机选择5个基因(MAPK13、CYP19A1、GREB1、SERPINE2、GSTA5)进行qRT-PCR表达量验证分析。结果表明:PDF2和ODF1转录组中共获得RPKM(The reads per kilobase per million reads)值≥0.5的表达基因15 413个,其中表达差异倍数(Fold change)≥2的差异表达基因共651个;对651个差异表达基因进行GO分析表明,参与生物过程(Biological process,BP)的基因占41.66%,分子功能(Molecular function,MF)占17.24%,细胞组分(Cellular component,CC)占41.10%;GO分析结合Genecards基因功能查询,共筛选出13个下调基因和17个上调基因与牛卵泡发育直接相关;CYP19A1、GREB1、SERPINE2在优势卵泡(Donminant follicles,DF)的表达量极显著高于从属卵泡(Subordinate follicle,SF)(P<0.01),MAPK13在SF表达量极显著高于DF(P<0.01),GSTA5在SF表达量显著高于DF(P<0.05)。5个基因差异表达趋势与转录组测序结果完全相符,也进一步证明了转录组测序结果的可信度,为深入探讨基因调控牛卵泡发育奠定了基础。展开更多
【目的】探讨牛卵泡颗粒细胞中可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)的表达对牛不同阶段卵泡发育的影响。【方法】通过对牛卵泡转录组ODF1(the largest onset of deviation follicle)和ODF2(the...【目的】探讨牛卵泡颗粒细胞中可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)的表达对牛不同阶段卵泡发育的影响。【方法】通过对牛卵泡转录组ODF1(the largest onset of deviation follicle)和ODF2(the second largest onset of deviation follicle)颗粒细胞(granulesa cells,GCs)构建RNA文库,Illumina Hi Seq 2000平台测序;采集屠宰牛双侧卵巢,通过黄体形态特征筛选处于第一卵泡波阶段的最大卵泡和第二大卵泡;分别抽取卵泡液,竞争性ELISA法测定卵泡液雌激素(estrodiol,E2)和孕酮(progestin,P)浓度,确定优势卵泡(dominant follicles,DF)和从属卵泡(subordinate follicles,SF);分别分离DF和SF颗粒细胞(granulosa cells,GCs),提取总RNA;设定3个重复样本,以RPLP0作为内参基因,设计引物在牛DF和SF进行q RT-PCR表达量检测,Graph Pad Prism 5.0作图并进行显著性分析;兔抗CART一抗检测CART在牛卵泡的表达。【结果】转录组测序结果显示,CART在ODF1的表达量是ODF2的38.2倍;通过黄体形态特征及激素测定共筛选出3头牛的卵泡发育处于第一卵泡波,并获得DF和SF;q RT-PCR结果显示CART在DF与SF的表达量差异极显著(P<0.01),高达2 310倍,与转录组测序结果的表达差异趋势一致;免疫组化结果表明,CART在牛DF和SF中均有表达,且DF表达量明显高于SF,同时,CART主要在卵泡颗粒细胞层表达。【结论】在牛卵泡发育过程中,卵泡发育选择期有其它抑制因子抑制了大多数卵泡的发育,阻止其成为DF;当出现偏差后,CART的高表达抑制了DF进入排卵期,推测CART可能是通过促进卵泡颗粒细胞的凋亡,进一步抑制了颗粒细胞层E2的分泌,最终导致DF闭锁。展开更多
文摘【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second largest follicle at predeviation,PDF2),构建RNA文库后Illumina平台测序,经数据库比对,设定参数筛选高表达基因、差异表达基因并进行GO分析,Genecards基因功能查询进一步筛选与卵泡发育直接相关的调控基因,q RT-PCR对筛选的基因进行表达量验证分析。【结果】两个转录本中共获得263个差异表达基因;GO功能聚类分析共分为三大类90组:其中生物学过程占64.4%,细胞组分占17.8%,分子功能占17.8%;获得一些重要的功能富集通路,如调控信号转导和细胞因子应答的生物途径;基因表达量分析筛选出10个高表达的上调和下调基因,获得参与雌激素合成和胎儿性别发育的CYP17A1、参与类固醇激素合成的LOC785462、细胞发育过程中调节细胞凋亡的DACH1以及调节ERK和MEK1/2信号通路的MAP3K3。Genecards功能查询共获得6个基因与卵泡发育关系较为密切,其中上调基因分别为PRSS35,PTGRF,ARID4B,GPR116;下调基因为APOA1和CPXM1;q RT-PCR结果显示,PRSS35和ARID4B在DF中的表达量显著高于SF(P<0.05),CPXM1在SF中的表达量极显著高于DF(P<0.01),PTGRF,GPR116和APOA1在DF和SF中的表达量不存在显著差异(P>0.05),但其表达变化趋势与高通量测序结果相一致。【结论】转录组测序结果真实可靠,PRSS35和ARID4B在卵泡发育过程中发挥正调控作用,CPXM1在卵泡发育过程中发挥负调控作用,获得的牛卵泡发育相关基因和重要调节途径,对后期深入探讨卵泡发育调控机理的研究具有重要意义。
文摘旨在筛选牛卵泡发育相关基因及其表达模式。本研究选取9头青年母牛,同期发情处理后,采集卵泡波中出现偏差前的小卵泡PDF2(The small follicle at onset of predeviation)和出现偏差后的最大卵泡ODF1(The largest follicle at onset of deviation),分离颗粒细胞(Granulesa cells,GCs),提取总RNA,并进行转录组测序;经牛RefSeq数据库搜索和差异表达基因筛选,进行GO(Gene ontology)分析;随机选择5个基因(MAPK13、CYP19A1、GREB1、SERPINE2、GSTA5)进行qRT-PCR表达量验证分析。结果表明:PDF2和ODF1转录组中共获得RPKM(The reads per kilobase per million reads)值≥0.5的表达基因15 413个,其中表达差异倍数(Fold change)≥2的差异表达基因共651个;对651个差异表达基因进行GO分析表明,参与生物过程(Biological process,BP)的基因占41.66%,分子功能(Molecular function,MF)占17.24%,细胞组分(Cellular component,CC)占41.10%;GO分析结合Genecards基因功能查询,共筛选出13个下调基因和17个上调基因与牛卵泡发育直接相关;CYP19A1、GREB1、SERPINE2在优势卵泡(Donminant follicles,DF)的表达量极显著高于从属卵泡(Subordinate follicle,SF)(P<0.01),MAPK13在SF表达量极显著高于DF(P<0.01),GSTA5在SF表达量显著高于DF(P<0.05)。5个基因差异表达趋势与转录组测序结果完全相符,也进一步证明了转录组测序结果的可信度,为深入探讨基因调控牛卵泡发育奠定了基础。
文摘【目的】探讨牛卵泡颗粒细胞中可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)的表达对牛不同阶段卵泡发育的影响。【方法】通过对牛卵泡转录组ODF1(the largest onset of deviation follicle)和ODF2(the second largest onset of deviation follicle)颗粒细胞(granulesa cells,GCs)构建RNA文库,Illumina Hi Seq 2000平台测序;采集屠宰牛双侧卵巢,通过黄体形态特征筛选处于第一卵泡波阶段的最大卵泡和第二大卵泡;分别抽取卵泡液,竞争性ELISA法测定卵泡液雌激素(estrodiol,E2)和孕酮(progestin,P)浓度,确定优势卵泡(dominant follicles,DF)和从属卵泡(subordinate follicles,SF);分别分离DF和SF颗粒细胞(granulosa cells,GCs),提取总RNA;设定3个重复样本,以RPLP0作为内参基因,设计引物在牛DF和SF进行q RT-PCR表达量检测,Graph Pad Prism 5.0作图并进行显著性分析;兔抗CART一抗检测CART在牛卵泡的表达。【结果】转录组测序结果显示,CART在ODF1的表达量是ODF2的38.2倍;通过黄体形态特征及激素测定共筛选出3头牛的卵泡发育处于第一卵泡波,并获得DF和SF;q RT-PCR结果显示CART在DF与SF的表达量差异极显著(P<0.01),高达2 310倍,与转录组测序结果的表达差异趋势一致;免疫组化结果表明,CART在牛DF和SF中均有表达,且DF表达量明显高于SF,同时,CART主要在卵泡颗粒细胞层表达。【结论】在牛卵泡发育过程中,卵泡发育选择期有其它抑制因子抑制了大多数卵泡的发育,阻止其成为DF;当出现偏差后,CART的高表达抑制了DF进入排卵期,推测CART可能是通过促进卵泡颗粒细胞的凋亡,进一步抑制了颗粒细胞层E2的分泌,最终导致DF闭锁。
