蜡块保存年限对乳腺癌HER2基因荧光原位杂交结果的影响

目的以浸润性乳腺癌HER2基因表达为研究对象,探讨蜡块保存年限对HER2基因荧光原位杂交(FISH)检测结果的影响。方法回顾性收集2012年1月至2017年12月在首都医科大学附属北京友谊医院病理科初诊为原发浸润性乳腺癌的石蜡样本70例,其中免疫组织化学检测HER2蛋白2+且FISH检测HER2基因扩增的病例每年度10例,共60例,归为Fp组,包括手术切除标本32例,穿刺标本28例;另外选取2012年1月至2012年12月HER2蛋白2+且FISH检测HER2基因未扩增的病例10例,作为阴性对照,归为Fn组,包括手术切除标本5例,穿刺标本5例。将所有病例的归档蜡块以4μm厚度连续切片2张,一张用于苏木精和伊红染色以确定肿瘤位置,另一张重新进行FISH检测,切片预处理采用高温高压热修复方法,胃酶消化使用光学显微镜观察控制。最后按照乳腺癌HER2检测指南(2019版)进行判读并将计数的平均HER2拷贝数/细胞、平均CEP17拷贝数/细胞以及HER2/CEP17比值与初诊结果进行对比。结果Fp组60张切片中,除1张2016年的穿刺组织杂交失败外,其余组织均杂交成功,成功率为98.33%(59/60),成功的切片均判读为阳性,与初诊结果符合率为100%;Fn组10张切片全部杂交成功且均判读为阴性,与初诊结果符合率为100%。Fp组、Fn组中平均HER2拷贝数/细胞、平均CEP17拷贝数/细胞以及HER2/CEP17比值与初诊结果相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论保存5~10年的乳腺癌归档蜡块,采用高温高压热修复后行HER2基因FISH检测,成功率高、结果准确,可为初诊HER2 IHC 2+但未行FISH检测的癌转移患者在抗HER2靶向用药的筛选中提供一定的依据。

甲酸表面脱钙法在骨髓活检荧光原位杂交制片中的应用

目的对骨髓活检组织使用甲酸溶液进行表面脱钙,提高其石蜡切片荧光原位杂交检测的成功率,为骨髓内淋巴瘤的精确诊治及预后判断提供分子生物学依据。方法回顾性收集2015年1月至2022年5月间首都医科大学附属北京友谊医院病理科骨髓活检组织58例,其中套细胞淋巴瘤33例,弥漫大B细胞淋巴瘤21例,滤泡性淋巴瘤4例。根据常规制片前所用脱钙液和脱钙方式的不同,将实验分为3组:硝酸传统脱钙组(DG1)、硝酸表面脱钙组(DG2)和甲酸表面脱钙组(DG3)。其中DG2组和DG3组蜡块在荧光原位杂交制片前,需放入50%甲酸溶液中二次脱钙10 min,流水冲洗10 min。之后对3组蜡块进行连续切片,每例捞取组织面2张,分别用于苏木素和伊红染色和杂交检测。结果DG1组、DG2组和DG3组杂交的成功率分别为5.6%(1/18)、94.7%(18/19)和95.2%(20/21)。与DG1组相比,DG2组和DG3组杂交成功率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。DG2组和DG3组成功率之间差异无统计学意义(P>0.05)。DG2组13例MCL和1例FL、DG3组8例MCL和2例FL中的CCND1/IGH和BCL2/IGH融合探针检测均为阳性。DG1组1例DLBCL、DG2组5例DLBCL、DG3组11例DLBCL细胞内MYC基因均未出现异常断裂信号,表现为两个红绿融合的黄色信号。杂交成功的切片上组织结构完整,细胞轮廓清楚,信号定位准确。结论甲酸表面脱钙法脱钙速度快,荧光原位杂交检测成功率高,结果准确。甲酸代替硝酸,配制安全而且容易购买。该法在骨髓活检FISH制片中的应用具有重要的临床价值,应用前景广阔,值得推广。

骨髓活检在EBER原位杂交检测中消化时间的优化

目的优化骨髓活检样本在EB病毒编码的小RNA(EBER)原位杂交检测中的消化时间。方法对20例EB病毒相关疾病的骨髓活检样本,连续切片3张,分为3组,使用同一浓度的蛋白酶K,对3组切片进行间隔5 min的梯度时间消化,然后继续进行EBER原位杂交的其它检测步骤,并对结果进行判读。结果消化时间为10 min组的切片,杂交效果最好,组织结构完整,阳性细胞着色深,定位准确,背景干净,结果清晰易辨。结论骨髓活检样本与其他活检组织相比,在EBER原位杂交检测中的消化时间要适当延长,以10 min最佳。

荧光原位杂交和原位杂交联合免疫荧光检测EBER的可行性比较

目的探讨利用荧光原位杂交(FISH)和原位杂交(ISH)联合免疫荧光(IF)两种方法检测EB病毒编码的小RNA(EBER)的可行性。方法收集首都医科大学附属北京友谊医院病理科2016年7月至2017年1月诊断的淋巴瘤患者20例,EBER原位杂交检测均为阳性。每例取蜡块进行切片,每张厚3μm,4张连续切片分为四组:荧光原位杂交及其阴性对照,原位杂交联合免疫荧光及其阴性对照。通过荧光显微镜查看两种荧光方法的效果。结果利用荧光原位杂交与原位杂交联合免疫荧光的方法检测EBER,均可以使EBER阳性细胞显示出阳性绿色荧光信号,且阴性对照无阳性荧光信号。后者更敏感,背景更少。结论荧光原位杂交与原位杂交联合免疫荧光这两种方法都可以有效地应用于EBER的检测,且这两种方法可能会成为EB病毒相关疾病诊断的实验室检查方法。

EB病毒编码的小RNA荧光双重标记技术的建立

目的利用原位杂交联合免疫荧光建立EB病毒编码的小RNA(EBER)的荧光双重标记方法。方法收集2018年12月至2019年11月于首都医科大学附属北京友谊医院病理科诊断为淋巴瘤患者的蜡块20例,其EBER原位杂交检测结果均为阳性。每例取蜡块进行连续切片,每例切片2张,其中1张切片进行荧光双重标记,另1张作为阴性对照。通过荧光显微镜查看双重荧光标记的效果。结果荧光双重标记成功后细胞和组织结构完整。原位杂交联合免疫荧光阳性的细胞核呈绿色荧光,免疫荧光阳性的细胞膜呈红色荧光,双重标记阳性细胞的膜与核红绿荧光对比鲜明。结论建立了一种新的EBER荧光双重标记方法,且此方法可以用于判断EB病毒感染的细胞属于B细胞还是T细胞,有助于淋巴瘤的诊断。

非小细胞肺癌患者驱动基因突变及临床病理特征分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)驱动基因突变与临床病理特征的关系。方法采用ARMS法检测NSCLC患者常见驱动基因EGFR、ALK、ROS1、KRAS、NRAS、HER2、PIK3CA、RET基因突变、融合等异常,并分析其与临床病理特征的关系。结果279例NSCLC患者EGFR基因突变率最高(41.9%,117/279),突变易发生于女性、腺癌、年龄<60岁、不吸烟、临床分期Ⅰ~Ⅱ期患者;突变类型以19-del和L858R为主,分别为53.0%(62/117)和38.5%(45/117),其次为KRAS(10.8%,30/279)、ALK(5.4%,15/279);KRAS基因突变易发生于男性,ALK基因融合易发生于年龄小于60岁的患者。检出2例EGFR基因双位点突变及5例两种不同基因共存突变。RET、ROS1、PIK3CA、HER2及NRAS基因异常发生率较低,其中NRAS基因最低。肺手术切除、肺活检、转移灶、胸水脱落细胞制蜡块标本在基因检测中差异均无统计学意义(P>0.05)。结论多基因联合检测有助于分析NSCLC驱动基因异常及可能存在的突变共存状态,在疾病进展不同时期检测可获得的肺手术切除标本、肺活检、转移灶或胸水标本,对于筛选出适用靶向药物的目标人群均具有重要意义。

原位荧光杂交检测在骨髓活检切片中的方法建立及优化

目的建立及优化骨髓活检石蜡切片原位荧光杂交(FISH)检测流程。方法建立和优化骨髓活检石蜡切片FISH检测步骤和实验条件,在20例骨髓活检组织,其中5例诊断为套细胞淋巴瘤(MCL),应用FISH检测IGH/CCND1探针。结果建立骨髓活检石蜡切片的FISH检测步骤和实验条件,5例确诊MCL骨髓活检石蜡切片可检测到IGH/CCND1融合信号。证明本方法的可行性。结论骨髓活检石蜡切片FISH检测可以获得信号清晰、核形态较好、背景清晰的FISH染色结果,可以满足临床应用要求。

循环荧光原位杂交在淋巴瘤诊断中的价值研究

目的在单张淋巴瘤石蜡切片上建立循环荧光原位杂交检测的方法,为需要多基因检测的淋巴瘤患者在组织或切片不足的情况下提供及时有效的诊断。方法回顾性收集2020年1月至2021年5月首都医科大学附属北京友谊医院病理科(北京市临床医学研究所淋巴瘤诊断研究中心)和外院会诊的淋巴瘤病例共27例,其中本院10例,外院会诊17例。27例均进行过MYC、BCL2和BCL63种基因的FISH检测,每例切片3张。根据杂交的不同将实验分为3组:杂交1组(HG1):将3张切片分别滴加MYC、BCL2、BCL6探针并按我科室常规荧光原位杂交方法操作。杂交2组(HG2):将HG1组中杂交MYC探针的切片使用本文介绍的循环荧光原位杂交方法,滴加BCL2探针进行第2次杂交。杂交3组(HG3):将HG2组的切片用循环方法滴加BCL6探针进行第3次杂交。观察3组切片红、绿荧光信号的有无、信号模式及组织、细胞结构情况。结果HG2组和HG3组循环荧光原位杂交的成功率均为100%。循环杂交后,HG2组中BCL2基因和HG3组中BCL6基因断裂阳性、阴性及扩增病例与HG1组完全相符,每张切片上基因表达异常的细胞数目与HG1组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。HG2组和HG3组在循环杂交后,切片上的组织结构完整,细胞轮廓清晰,信号明亮清晰、定位准确。结论循环荧光原位杂交检测法可以在同一张切片上多次杂交不同的基因探针,方法简便,成功率高,结果准确,可有效解决淋巴瘤患者因组织或切片不足而无法进行多基因检测的问题,在淋巴瘤诊断中具有实用价值。

多次重复荧光原位杂交制片技术在淋巴瘤诊疗中的应用研究

目的建立多次重复荧光原位杂交制片技术,用以在切片不足的情况下辅助淋巴瘤诊疗。方法收集20例包含不同程度的基因断裂、基因扩增情况且诊断为淋巴瘤的石蜡组织,每例连续切片4张。将杂交分为三组:第一次杂交组(FHG):第一次分别杂交C-MYC基因断裂探针、BCL-2基因断裂探针和BCL-6基因断裂探针;第二次杂交组(SHG):取FHG杂交C-MYC基因断裂探针切片,使用重复荧光原位杂交技术再次杂交BCL-2基因断裂探针;第三次杂交组(THG):在第二次杂交基础上再次使用该技术杂交BCL-6基因断裂探针。观察FHG组,SHG组,THG组镜下红绿信号的表达情况:包括红绿信号是否表达及信号的表达模式。记录结果后对三组中孵育相同探针的切片的信号情况进行对比。并且观察三组切片是否保持完整。结果SHG组镜下出现有效荧光信号比率为100%(R1=20/20×100%),THG组在镜下出现有效荧光信号比率为100%(R2=20/20×100%)。在本次实验中多次重复荧光原位杂交制片技术的成功率为100%(R=R1×R2)。在符合率方面,BCL-2基因断裂探针在FHG组和SHG组具有相同的信号模式和阳性比率;同时BCL-6基因断裂探针在FHG组和THG组也具有相同的信号模式和阳性比率;三组FISH杂交染色中只有两张切片具有部分掉片的情况,但不影响信号判读。证明在该方法下切片具有较好的完整性;该多次重复荧光原位杂交技术具有可行性。结论多次重复荧光原位杂交制片技术可以在一张切片上重复杂交不同探针,且每次均可获得信号清晰、形态较好、背景清晰的FISH染色结果。可以在切片不足的情况下,满足临床诊断、治疗需求。

旋毛虫膜蛋白新基因Tmp10的免疫筛选及鉴定

目的免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,寻找抗旋毛虫病的疫苗候选抗原或诊断抗原。方法应用旋毛虫感染的猪血清免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,获得阳性克隆。将一阳性克隆与原核表达载体p ET-28a(+)构建重组质粒,异丙醇硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导后,利用亲和层析柱纯化目的蛋白,并通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和Western blotting鉴定其抗原特异性和免疫原性。结果免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得42个阳性克隆,选取一个新基因Tmp10,成功构建了重组质粒p ET-28a(+)/Tmp10,诱导表达后获得的重组蛋白(r Tmp10)的相对分子质量约为40 000。Western blotting检测结果显示,该重组蛋白可被旋毛虫感染小鼠和猪血清所识别,具有抗原特异性。r Tmp10免疫小鼠可诱导产生高滴度的抗体,显示其具有较好的免疫原性。结论免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得一个新基因Tmp10,生物信息学分析预测其为膜蛋白,其重组蛋白(r Tmp10)具有较好的抗原特异性和免疫原性。

旋毛虫Hsp70与乃87融合蛋白的构建表达及鉴定

本文构建并表达了旋毛虫热休克蛋白70（Ts—Hsp70）与排泄分泌抗原Ts87的融合蛋白，并对融合蛋白进行纯化和免疫学鉴定。本研究采用限制性内切酶EcoRI酶切位点将目的基因Ts—Hsp70与Ts87相连接，插入pET28-a（＋）质粒，转人大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达、纯化，获得的融合蛋白rTs—Hsp70-Ts87用Western blot的方法鉴定。经PCR、酶切鉴定、测序分析，结果显示，目的基因片段大小为2721bp，构建的重组质粒与预期相符。经IPTG诱导表达，通过镍离子柱层析纯化复性后得到可溶的融合蛋白rTs—Hsp70-Ts87，其相对分子质量约为100kDa；Western blot结果显示，该蛋白可被抗His标签单抗、rTs—Hsp70免疫血清、rTs87免疫血清识别。以上结果表明，本研究成功构建并表达了融合蛋白rTs．Hsp70-Ts87，为进一步研究rTs—Hsp70-Ts87的免疫保护性，开发新的有效抗旋毛虫病的疫苗奠定基础。